[发明专利]一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用

说明书

本发明提供了一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用。具体地，本发明提供了一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：(a)向导DNA(gDNA)；(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。并且，本发明还提供了基于本发明的可编程核酸内切酶TpsAgo的一种富集和检测低丰度目标核酸的体系和方法。本发明所提供的检测体系和方法能够特异性地针对低丰度的核酸进行有效富集和高效检测，并且本发明的可编程核酸内切酶TpsAgo具有强大的基因操作潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白最早在一项描述拟南芥的突变体的研究中被提及。Ago蛋白是真核RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者，可以在转录后调节基因表达，从而防御宿主入侵的RNA病毒并保护基因组完整性。目前已报道的Ago蛋白主要分为真核Ago(eAgo)和原核Ago(pAgo)两类。

原核Ago可以结合单链的guide DNA或RNA，催化与guide互补配对的靶标DNA或RNA的剪切。与CRISPR/Cas系统不同，原核Ago在对靶标核酸链进行剪切时，不需要PAM序列，它可以结合与靶标核酸互补的guide DNA或RNA，在靶标的任意互补对应的位置进行剪切。

来源于古菌的高温Ago蛋白可在70℃以上发挥剪切活性，目前已表征的高温Ago一般可以在高温条件下，结合单链guide DNA或RNA，剪切靶标单链DNA，少数也可以剪切靶标单链RNA。

近年来“液体活检”的概念正在兴起，其基本思想为运用血液等体液样本替代肿瘤组织样本行病理学、分子生物学的检测，通过检测患者体液样本(主要是血液)中的肿瘤循环DNA来获取肿瘤基因突变信息已经成为一种趋势。循环肿瘤DNA虽然是一种很好的肿瘤组织替代样本，但是，由于循环肿瘤DNA含量稀少，检测循环肿瘤DNA需要极灵敏的技术。目前的检测技术主要依赖于二代测序及数字PCR技术，但是他们均在灵敏度、运行成本方面具有一定局限性。

因此，本领域迫切需要开发一种高特异性、高灵敏度的低丰度突变DNA的富集及检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高特异性、高灵敏度的低丰度突变DNA的富集及检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸切割体系，所述核酸切割体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和

(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。

在另一优选例中，所述核酸切割体系的温度为65-90℃，较佳地为70-85℃，更佳地为75-85℃。

在另一优选例中，所述的可编程核酸内切酶Argonaute选自下组：TtAgo、TpsAgo、SeAgo、RsAgo、KpAgo、hAgo1、hAgo2、MpAgo、TpAgo、PfAgo、MjAgo、MfAgo、NgAgo、LrAgo、AaAgo、CbAgo、CpAgo、IbAgo、KmAgo。

在另一优选例中，所述的可编程核酸内切酶Argonaute来源于嗜热菌(Thermusparvatiensis)，所述的可编程核酸内切酶Argonaute是可编程核酸内切酶TpsAgo。

在另一优选例中，所述的TpsAgo包括野生型和突变型的TpsAgo。

在另一优选例中，所述野生型的可编程核酸内切酶TpsAgo的氨基酸序列如NCBI序列号WP_060384876.1所示。