[发明专利]一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用

权利要求书

1.一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器为单支级联引物交换反应PER体系，包括外泌体PD-L1、信号识别部分和信号转换部分，所述信号识别部分包括能与外泌体PD-L1结合的适体，所述适体上含有一段被封闭的引物序列，外泌体PD-L1与适体结合，使引物暴露；所述信号转换部分为：所述引物与发夹结合触发级联引物交换反应，生成产物，所述产物与硫磺素ThT 结合产生荧光，实现外泌体PD-L1的检测；

所述适体为适体AP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5'-ACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTTAACAGGTTCCCC-3'；

所述适体包含的引物选自引物1或引物2中的至少一种，所述引物1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示：5'-GGTTCCCC-3'，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5'-TCATCTTCTTCATTGAAGATGAC-3'；

所述发夹选自发夹A与发夹B；

所述发夹A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

5'-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACGGGGAACGInvdT-3'；

所述发夹B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

5'-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCInvdT-3'；

所述产物为具有TTTAGGG重复序列域的长分支链。

2.根据权利要求1所述的检测外泌体PD-L1的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）适体结合外泌体PD-L1：将适体AP 与外泌体PD-L1共同孵育，得A-PDL1复合物；

（b）取步骤（a）所得产物A-PDL1复合物，与发夹混合，孵育，构建级联引物交换反应；

（c）将硫磺素ThT溶液加入步骤（b）所得的反应液中，混合、孵育，得荧光检测体系。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：通过超速离心法从血清样本中提取外泌体PD-L1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述超速离心法为：在血清样本加入PBS缓冲液，先低速离心，吸取上清液，进行第一次高速离心，过滤去除血清中的细胞和凋亡碎片；进行第二次高速离心，去除蛋白质和较大的细胞外囊泡，取沉积物，用PBS洗涤；最后进行第三次高速离心，获取外泌体沉积物。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）、（b）中，适体和发夹的摩尔比为1:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，适体AP要先进行变性退火，然后再与外泌体共同孵育，适体AP的变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，适体AP和外泌体的孵育温度为37℃，时间为1-2h。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）所需的反应溶液还包括：10× NEBuffer3.0缓冲液、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP， Klenow Fragment DNA聚合酶。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）中，孵育温度为37℃，孵育时间为2-3h。

10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中，还需要加入PBS缓冲液。

11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中，硫磺素ThT溶液由硫磺素ThT加水配制而成，浓度为80-120 mM。