[发明专利]一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种检测外泌体PD‑L1的荧光传感器及其制备与应用，所述传感器包括外泌体PD‑L1、信号识别部分和信号转换部分，信号识别部分包括适体，适体上含有一段被封闭的引物序列，外泌体PD‑L1与适体结合使引物暴露；信号转换部分为：引物与发夹A结合触发级联引物交换反应(PER)，生成产物，产物与硫黄素ThT结合产生荧光，实现外泌体PD‑L1的检测。本发明首次将级联PER反应用于检测外泌体PD‑L1，通过PER的信号放大作用结合，使荧光信号进一步放大，提高灵敏度和特异性；无需洗涤，能一步法实现检测，操作简便；利用适体识别外泌体，适体可通过程序设计，无需复杂的DNA抗体偶联，且适体空间位阻较小可有效识别外泌体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC，也称为原发性肝癌)是世界上最常见的癌症之一。每年大约有84万新发的HCC病例，并且至少有78万人死于HCC。肝癌的主要治疗方案是手术切除、肝移植、放疗或化学药物局部给药以及联合治疗。然而，由于HCC起病的隐匿性和缺乏特定的早期标志物，大多数患者通常被诊断时已经是晚期，不再适合手术治疗，生存时间通常只有6个月。射频消融(RFA)目前是较小的HCC的一线治疗，具有与外科手术切除相似的功效，并且损伤小、恢复快。然而，由于消融能量在肿瘤中的分布不均，杀死远端或末梢癌细胞的效率不高，可能导致残留肿瘤的存在。经导管动脉化疗栓塞(TACE)是晚期肝癌的另一种一线治疗方法。然而，由于缺氧后肿瘤中的代偿性血管增生，治疗效果也不能令人满意。索拉非尼是晚期肝癌的主流靶向治疗药物，可以显着延长患者的中位生存期，但在治疗后期逐渐会出现耐药性。因此，鉴定HCC的早期特异性诊断标志物并解决耐药性和疾病复发的问题是临床实践中的紧迫问题。

肝癌的发生和发展是一个极其复杂的病理过程，其潜在的分子机制仍不清楚。大量的基础和临床研究表明，病毒感染、酒精和非酒精性肝毒性是HCC的主要原因，而其发病机理尚不清楚。近年来，体内和体外实验都证明外泌体可能在肝癌的发生、发展、诊断和治疗中起关键作用。在肝脏中产生外泌体的细胞类型主要是肝实质细胞(例如肝细胞)、非实质肝内免疫细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、T/B细胞和自然杀伤细胞)、以及各种非实质性肝基质细胞(如星状细胞)。外泌体被包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)在内的各种病毒所利用，将病毒RNA复合物传递至相邻的正常肝细胞，并通过浆细胞样树突状细胞(PDC)诱导非特异性免疫反应，以及引起T细胞抑制的特异性免疫反应。HCC细胞还可以通过产生抑制免疫应答的外泌体来逃避肿瘤的免疫监视。例如，侵袭性很强的肝癌细胞能够表达PD-L1(细胞程序性死亡-配体1)免疫检查点蛋白，它与免疫细胞上的PD-1受体相结合，能够抑制免疫反应。因此，外泌体PD-L1在肝癌的发展、诊断和治疗中起着关键作用，并具有广泛的临床应用。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力，目前也有。但RCA需要合成DNA环型模板和连接链，过程比较复杂。因此，有必要构建一种更加简便、且灵敏度和特异性好的外泌体PD-L1检测策略具有重要的临床意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用，本发明创新地提出了一种单步无标记的外泌体PD-L1荧光成像的生物传感策略，通过适体激活引物交换反应，结合荧光分子后产生放大且可靠的荧光，从而实现肝癌细胞来源的外泌体PD-L1的原位检测。