[发明专利]产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用

权利要求书

1.一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括步骤：

步骤一、采样及样品处理

从不同大蒜种植地土壤中取土样50份，称取每份土样10g，置于装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中，使用发酵振荡器在120r/min旋转振荡混匀1h，然后将三角瓶置于80℃震荡水浴锅中，震荡孵育处理30-40min，获得土样悬浊液；

步骤二、富集培养

从步骤一的土样悬浊液三角瓶中吸取1-2mL悬浊液到装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养2-3d，将以上培养液于5000-6000r/min离心10-15min，无菌操作下收集菌体，然后加入无菌水充分吹打悬浮，再次于以上相同条件下离心，洗涤菌体，离心后收集菌体并按照初始培养液每100ml加入50ml无菌水重复悬浮，吸取1-2ml悬浮液接种于装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养4-6d，得到富集培养菌液；

所述富集培养基包括蛋白胨1-2g、玉米芯粉10-20g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaNO₃ 1-3g、(NH₄)₂SO₄ 2-4g、KH₂PO₄ 0.5-1g、KCl 0.1-0.5g，去离子水加至1000ml，调节pH 7.0-7.5，培养基121℃、15min灭菌；

步骤三、初筛

将经两次富集培养后的菌液充分系列稀释10⁴～10⁸倍，然后吸取各稀释液100-200μL于阿魏酸酯酶初筛培养基上，充分涂布均匀并晾干表面，于35-40℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后在28-32℃倒置培养24-48h，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现；将透明圈菌落挑出在牛肉膏蛋白胨培养基上充分划线三次，将充分划线获得的单菌落点到平行的两个细菌素初筛培养基二上，其中一个培养皿命名为培养皿一，另一个命名为培养皿二，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后在30-35℃倒置培养24-48h；将培养皿置于超净工作台上，开启可产臭氧的紫外灯，照射1-2h，将培养皿一中加入500-1000μL浓度为5mg/ml的复合蛋白酶液，并使酶液完全覆盖平板表面，将该平板封口膜封口并置于37℃恒温培养箱中孵育6-12h，培养皿二不用蛋白酶处理；然后将培养至对数期的金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至1×10⁶CFU/mL，吸取0.5-1mL菌悬液平行加到培养皿一和培养皿二上，旋转培养皿，使菌悬液充分在平板上展开，然后将残余菌液倒掉，并晾干培养基表面，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，观察抑菌圈情况；

所述阿魏酸酯酶初筛培养基包括牛肉膏5-10g、酵母提取物5-10g、蔗糖10-20g、NaNO₃1-3g、(NH₄)₂SO₄ 2-4g、KH₂PO₄ 0.5-1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g、FeSO₄·7H₂O 0.01-0.02g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH 7.0-7.5；培养基121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中；

阿魏酸乙酯溶液包括将0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μL N、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀；

细菌素初筛培养基包括蛋白胨10-15g、酵母提取物5-10g、葡萄糖10-20g、玉米浆干粉5-10g、尿素2-4g、(NH₄)₂SO₄ 1-2g、KH₂PO₄ 0.5-1g、KCl 0.2-0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH 7.0-7.5、培养基121℃、15min灭菌；

步骤四、复筛

初筛得到菌株于活化固体培养基上划线培养充分活化，32-37℃恒温培养箱培养20-24h，将活化好的菌株接种到种子培养基三角瓶中，种子培养基装液量20-40mL/250ml三角瓶，培养温度为32-37℃，摇床转速160-180r/min，培养时间18-24h，按照6-12％的接种量接种到复筛发酵培养基中，250mL三角瓶的装液量为30-60mL；在摇床上以160-200r/min的震荡频率32-37℃温度下发酵培养36-48h，将发酵液在4℃下、8000-10000r/min转速离心10-15min，保留上清，分别检测阿魏酸酯酶活性和细菌素抑菌活性；

种子培养基：蛋白胨5-10g、牛肉膏4-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl 1-5g、K₂HPO₄ 0.1-0.2g，加去离子水至1000mL，pH7.0-7.5，121℃，灭菌15min；

复筛发酵培养基：玉米淀粉10-20g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl 2-5g、尿素1-4g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、Tween 80 0.15-0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.04g，去离子水加至1000mL，pH 7.0-7.5，121℃，灭菌15min。

2.一种权利要求1所述凝结芽孢杆菌的应用，其特征在于，包括步骤：

步骤一、液体发酵剂的制备

a)菌种活化：取甘油冷冻保存的凝结芽孢杆菌菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上初次划线后，30-37℃培养24-48h，从以上培养基上挑取单菌落再次重复在新的牛肉膏蛋白胨培养基上再次划线，同以上相同条件下培养，得到的单菌落备用；

b)一级种子液体培养基培养：从第二次划线培养的培养基上挑取单菌落至种子液体培养基，培养条件为：150mL三角瓶装种子液体培养基10mL-30mL，pH为6.5-7.2，接种一环菌体，32-37℃震荡培养器按照140-210r/min震荡培养12-24h，得到一级种子液；

采用的种子液体培养基：牛肉膏4-10g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-10g、葡萄糖10-20g、NaCl 0.05g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.04，蒸馏水加至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；

c)制备二级种子液：按照1-2v/v％的接种量吸取培养好的一级种子液至二级种子培养基中，培养条件为：100-200ml种子培养基装在500mL三角瓶中，在震荡培养器上按照150-210r/min震荡转速32-37℃下震荡培养1-2h，测定OD₆₀₀吸光值达到0.6-0.8，得到二级种子液；

采用的二级种子培养基：花生粕粉5-10g、可溶性淀粉10-20g、葡萄糖5-10g、蛋白胨5-10g、(NH₄)₂SO₄1-2 g、MgS0₄·7H₂O 0.01-0.02g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、去离子水定容至l000ml，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min；

步骤二、液体深层通风搅拌发酵工艺

a)发酵罐及培养基消毒

30L发酵罐发酵工艺：按照发酵罐60-70％(v/v)装液量，将配制好的发酵培养基通过罐体顶部装料口装入发酵罐中，将校正好的溶氧电极、pH电极插入安装孔内，并用螺母固定，连接电极电缆线；开启发酵罐搅拌；高压蒸汽，通过空气过滤器，并调节过滤器排气口使过滤器压表压力控制在0.11～0.12Mpa，并保持20-30min，同时对发酵罐的空气流通管路进行0.11～0.12Mpa、20-30min灭菌；灭菌结束后通入除菌后的空气吹干过滤器，并保证过滤器保持正压；将蒸汽通入发酵罐夹层，温度升至95-98℃后，将蒸汽通入发酵罐中，通过调节发酵罐罐体顶部放气阀调节发酵罐罐压，在12l℃下保持20-30min，灭菌结束后冷水通入发酵罐夹层，使培养基温度降至30-40℃，并通入无菌空气使发酵罐保持正压，压力维持在0.03～0.05MPa；

b)深层液体通风发酵控制

将活化培养好的二级种子液火焰保护下由发酵罐接种口倾倒入罐体，接种量为5-8％(v/v)，调节通气量并维持发酵罐罐压0.03-0.05Mpa，发酵过程采取分阶段精密控制工艺：发酵开始到发酵6h，发酵温度控制在35-37℃，通气量为8-10L/min，搅拌转速120-140r/min，发酵初始培养基pH 6.5-6.8；发酵6-12h，发酵温度维持不变，增加通气量至15-20L/min，提高搅拌转速至140-180r/min；发酵12-36h，每间隔6h向发酵液中补加浓缩补料培养基，每次补料400-800ml，调节发酵温度至32-35℃，通气量增加至25-35L/min，通过补加1mol/L的NaNO₃和氨水调节发酵液pH维持在6.8-7.2；发酵36-48h，停止补料，发酵温度增加到35-37℃，通气量增加至35-40L/min，搅拌转速维持不变，pH维持6.8-7.2；在此发酵条件条件下，细菌素抑菌活性达到2512U/ml，阿魏酸酯酶酶活力达到512U/L；

发酵培养基配方：花生粕粉10-20g、糖化好的玉米淀粉10-20g、蛋白胨5-10g、酵母粉10-20g、玉米浆干粉5-10g、尿素1-4g、Tween 80 0.15-0.3g、TritonX-100 0.2-0.4g、大量元素10ml、微量元素10mL、麸皮与玉米芯浸提液100-200ml、泡敌0.001g，最后加去离子水定容至1000mL；

其中，所述麸皮与玉米芯浸提液制备方法：将麦麸与玉米芯粉碎，然后加水，并加入盐酸，煮沸0.5小时，过滤取滤液，得到浸提液；

所述大量元素包括：KH₂PO₄ 20-30g/L、(NH₄)₂SO₄ 30-50g/L、KNO₃ 5-20g/L、(0.1g)MgSO₄·7H₂O 5-10g/L、CaCl₂·2H₂O 2-4g/L和NaCl 5-10g/L；

所述微量元素包括：MnSO₄·H₂O 0.2-0.4g/L、FeSO₄·7H₂O 50-80mg/L、CoCl₂·6H₂O100-200mg/L、ZnSO₄·7H₂O 40-80mg/L、CuSO₄·5H₂O 30-50mg/L、H₃BO₃ 10-20mg/L和NaMoO₄·2H₂O 5-10mg/L；

所述补料培养基包括：经蛋白酶部分水解后的豆粕粉10-20g、玉米浆干粉10-20g、甘蔗糖蜜10-30g、蚕蛹粉10-20g，去离子水定容至1000mL，121℃灭菌15min。