[发明专利]产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用

说明书

本发明公开一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用，包括步骤：步骤一、采样及样品处理；步骤二、富集培养；步骤三、初筛；步骤四、复筛。本发明中发酵所产细菌素具有广泛的抗菌谱，对常见的致病菌如单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，并能抑制包括副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌和大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌。本发明采用粗料培养基作为发酵原料，具有工艺简单、酶活性高、单位酶活生产成本低廉等优点，为阿魏酸酯酶的低成本化大规模生产提供依据。

技术领域

本发明涉及一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用。

背景技术

细菌素是细菌核糖体合成的抗菌肽，通常对多种致病菌具有杀菌作用，具有抗菌谱广、无毒、可被动物肠道蛋白酶降解等特性，在饲料工业中可以替代常规抗生素使用。饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物的耐药性。由于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临重大挑战。细菌素是被认为替代抗生素的最有前途的产品。它是一种具有杀菌的无毒小分子多肽。它可选择性地分解细菌细胞壁细胞膜杀死致病菌，且本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于饲料加工、医学、食品工业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域；可替代抗生素在饲料中应用，具有庞大的市场。细菌素主要由乳酸菌及芽孢杆菌属细菌发酵获得。芽孢杆菌产细菌素与乳酸菌产生的细菌素不同，乳酸菌细菌素抗菌谱窄和pH稳定性差，芽孢杆菌产生的细菌素在抑制活性和pH方面表现出更好的优越性。

阿魏酯酶(FAEs，E.C.3.1.1.73)是一类羧酸酯酶，催化植物细胞壁上羟基肉桂酸和糖之间的酯键水解，从植物细胞壁释放阿魏酸，它可以显著提高麦麸、玉米芯、玉米麸皮和草木质纤维素等材料的生物降解率，在动物饲料开发中显示出巨大的应用前景。然而，大多数报道的FAEs均为碱性或中性，在动物的酸性胃肠道环境中不能有效使用，限制了其在动物饲料中的应用。因此，寻找既安全又能直接用于动物胃肠道的新型FAEs是一项有价值的工作。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用的一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法，包括步骤：

步骤一、采样及样品处理

从不同大蒜种植地土壤中取土样50份，称取每份土样10g，置于装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中，使用发酵振荡器在120r/min旋转振荡混匀1h，然后将三角瓶置于80℃震荡水浴锅中，震荡孵育处理30-40min，获得土样悬浊液；

步骤二、富集培养

从步骤一的土样悬浊液三角瓶中吸取1-2mL悬浊液到装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养2-3d，将以上培养液于5000-6000r/min离心10-15min，无菌操作下收集菌体，然后加入无菌水充分吹打悬浮，再次于以上相同条件下离心，洗涤菌体，离心后收集菌体并按照初始培养液每100ml加入50ml无菌水重复悬浮，吸取1-2ml悬浮液接种于装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养4-6d，得到富集培养菌液；

所述富集培养基包括蛋白胨1-2g、玉米芯粉10-20g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaNO₃1-3g、(NH₄)₂SO₄2-4g、KH₂PO₄0.5-1g、KCl 0.1-0.5g，去离子水加至1000ml，调节pH 7.0-7.5，培养基121℃、15min灭菌；

步骤三、初筛