[发明专利]一种软体动物通用宏条形码扩增引物及其应用方法

说明书

本发明属于DNA检测技术领域，公开了一种软体动物通用宏条形码扩增引物及其应用方法。本发明的方法依据常见软体18S基因序列设计了6条宏条形码扩增引物，包括3条上游引物和3条下游引物，该引物对软体动物群落覆盖度广、扩增效率高，引物组合可以扩增出长度为200bp至350bp的产物，兼容不同高通量测序平台，这种多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率，可广泛用作特征条码序列进行软体动物物种鉴定、软体动物多样性分析等研究。

技术领域

本发明属于DNA检测技术领域，公开了一种软体动物通用宏条形码扩增引物及其应用方法。

背景技术

软体动物也称贝类，是软体动物门动物的统称，是除节肢动物外最大的类群，约10万种。体制的差异很大，但有共同的特征：体柔软而不分节，一般分头-足(有的头退化或消失；足肌肉质)和内脏-外套膜(由背侧的内脏团、外套膜及外套腔组成)两部分。

软体动物的栖息地非常辽阔，从热带大陆到南北极的海洋，从海拔7000米以上的高地池塘到800多米以下的深海。软体动物种类繁多,仅次于节肢动物-现存种类超过10万种。它们的形态差别很大，但都具有柔软的身体。它们大多数生活在海洋中，只有部分双壳类和腹足类迁移到半咸水和淡水中栖息。

针对软体动物的DNA检测，经检索，现有技术公开了相关的申请案，如中国专利申请号为2012104811798，公开日期为2013年03月06的申请案公开了一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物对森林葱蜗牛的分子特征进行识别；其PCR反应的上游引物为CN-(P1)：5’-ACCTCCTTCCTTTCTACT-3'，下游引物为CN-(P2)：5'-GTCAACATCTATCCCAAC-3'。PCR反应体系总体积为25uL，其中2×TaqPCRMasterMix12.5uL，上、下游引物各0.5uL，DNA模板2uL，余下用灭菌ddH20补足；PCR反应程序为：5℃预变性5min；95℃50s，52℃30s，72℃50s，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。该方法虽然能够快速、准确地检测鉴定森林葱蜗牛，然而该专利是针对某一个物种设计的，仅能用于森林葱蜗牛该物种的检测，无法覆盖整个软体动物。

再如中国专利申请号为2019110516175，公开日期为2020年02月04申请案公开了一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，所述正向引物序列为：ACAATGACGGTTTCAGCGAGT(SEQ ID No.1)，反向引物序列为：CACAAACAACCCGACTCCAAGG(SEQID No.2)。该申请案的方法还公开了该通用引物的设计和扩增方法以及用途。该申请案的通用引物是基于核糖体内转录间隔区(ITS)两端保守的18SrDNA和28SrDNA序列设计，所得到的引物特异性极强。同样，该申请案的方法也只能用于后睾科吸虫的精准检测，无法覆盖整个软体动物的物种。

软体动物是指示水环境好坏的重要指示物种，是流域生态健康评价的重点监测对象之一。目前，对软体动物的监测流程包括样本采集、人工挑拣、形态鉴定等步骤，耗时长、人力成本高、高度依赖物种鉴定专家，在实际生态健康评价中存在诸多局限性。而现有的针对软体动物的检测方法均是只能检测到特定物种，不能完全覆盖到整个软体动物，无法通过一次性的检测实现多种软体动物的鉴定及分类。

基于现有技术的缺陷，亟需发明一种能够全面覆盖的软体动物的DNA检测方法。

发明内容

1.要解决的问题

目前，对软体动物的监测流程包括样本采集、人工挑拣、形态鉴定等步骤，耗时长、人力成本高、高度依赖物种鉴定专家，在实际生态健康评价中存在诸多局限性。针对上述问题，本发明提供了一组基于核糖体18S基因的软体动物PCR扩增引物及应用方法，该引物对对软体动物群落覆盖度广、扩增效率高，采用多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率，可广泛用作特征条码序列进行软体动物物种鉴定、软体动物多样性分析等研究。

2.技术方案