[发明专利]新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备

说明书

本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由新型冠状病毒N蛋白两个优势表位重复串联组成。本发明还涉及用该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应新型冠状病毒N蛋白单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体，通过胶体金正交实验确定两对最优单克隆抗体配对组合。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明表达了一种新型冠状病毒N重组蛋白，涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，并应用于新型冠状病毒的感染诊断。

背景技术

2019新型冠状病毒，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒粒子呈不规则形状，其蛋白分为：刺突糖蛋白(S蛋白)、包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)，和核衣壳蛋白(N蛋白)。N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。

目前，新型冠状病毒检测以核酸分子检测为主，需要从痰液、咽拭子、肺泡灌洗液等样本中提取核酸分子，然后再采用荧光PCR方法进行检测，总共需要3个小时左右。该方法虽然准确度高，但是需要专门的操作场地、专业的操作人员和设备，检测时间太长，要求较为苛刻，无法在基层医疗机构大面积使用。而新型冠状病毒疫情爆发后，疑似患者大量增加，急需一种检测产品能在短时间内快速鉴别筛查，而不仅仅是确诊。

免疫学检测方法因其操作简便，结果易于判定，适用于大量样本现场快速筛查等特点而得到非常广泛的应用。该方法主要是通过制备新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体来实现对新型冠状病毒的特异性检测。常规新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备是将新型冠状病毒N蛋白单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。

发明内容

设计目的：为解决传统制备单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成重组新型冠状病毒N蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。