[发明专利]一种定量检测NPM1基因突变的drop-off ddPCR方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于drop‑offddPCR检测NPM1基因突变的检测方法和试剂盒，其引物和探针是根据NPM1基因DNA序列设计的，针对NPM1基因第12外显子突变热点设计了两条野生型探针，一条位于突变热点上，一条位于突变热点外，当突变热点存在插入、替换、缺失等突变时，位于突变热点的野生型探针则不能与模板紧密结合，所以该试剂盒仅用两对引物探针即可检出NPM1基因第12外显子突变热点的多种突变，并且其灵敏度高，可用于MRD监测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种定量检测NPM1基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

核磷蛋白1(nucleophosmin，NPM1)基因位于人类染色体5q35，共有12个外显子，其蛋白质由294个核苷酸组成。NPM1突变是急性髓系白血病(AML)最常见的基因突变之一。AML病例中NPM1突变的检出率为25％-35％，在细胞遗传学正常的AML(CN-AML)中的检出率超过50％，在骨髓增生性疾病和髓系发育不良性疾病中也有发现。迄今为止，已发现约50个NPM1外显子12突变，大多数突变为863位至864位核苷酸之间的插入。NPM1突变在疾病过程中非常稳定，因此是AML中较好的诊断和疾病监测的重要分子标记之一。

微小残留病(minimal residual disease，MRD)是指血液系统肿瘤在接受治疗后获得形态学缓解，无临床症状但仍然在体内存在的亚显微镜病变。MRD检测对于AML的预后判断以及分层治疗具有重要的指导意义，近年来，NPM1突变水平已被用于AML患者进行MRD监测的重要指标之一。有研究显示，治疗后MRD水平与预后相关，伴NPM1突变的AML患者诱导化疗结束后，NPM1突变基因转阴或处于低水平与MRD处于高水平相比具有更低的复发率以及更长的总生存率(overall survival，OS)。

目前临床上有多种检测NPM1基因突变的方法，主要方法有Sanger测序、二代测序、实时荧光定量PCR等。Sanger测序法被认为是检测基因突变的金标准，但灵敏度低，不适用于临床MRD检测。二代测序通量高、灵敏度高，但其成本高、操作难度大，难以在临床中应用于单基因的MRD监测。实时荧光定量PCR无法进行绝对定量，不适用于MRD监测。传统的ddPCR方法，灵敏度高，可直接反应NPM1突变负荷水平，但检测的突变类型较为单一，且仅可检测已知突变，对于突变热点上的多种突变类型检测较为繁琐，容易遗漏。因此，对初诊患者NPM1基因突变筛选以及MRD监测需要进一步优化。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明提出一种定量检测NPM1基因突变的drop-offddPCR方法和试剂盒。本发明提供的用于drop-off ddPCR技术检测NPM1基因突变的引物和探针是根据NPM1基因DNA序列设计的，针对NPM1基因第12外显子突变热点设计了两条野生型探针，一条位于突变热点上，一条位于突变热点外，当突变热点存在插入、替换、缺失等突变时，位于突变热点的野生型探针则不能与模板紧密结合，所以该试剂盒仅用两对引物探针即可检出NPM1基因第12外显子突变热点的多种突变，并且其灵敏度高，可用于MRD监测。

为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种采用drop-off ddPCR定量检测NPM1基因突变的试剂盒，包含针对NPM1基因的特异性引物对和探针，其中引物的序列如下：

NPM1正向引物：5’-ATGAAGTGTTGTGGTTCCTT-3’

NPM1反向引物：5’-CAGAAATGAAATAAGACGGAAAA-3’。

进一步的，所述探针序列如下：

NPM1突变位点野生型探针：5’-FAM-AGATCTCTGGCAGTGGAGG-BHQ1-3’

NPM1突变位点外野生型探针：5’-VIC-TGTTTAAACTATTTTCTTAAAGAGACT-BHQ1-3’，