[发明专利]一种高效的从河豚内脏提取和分离制备高纯度河豚毒素的方法

说明书

本发明公开一种高效的从河豚内脏提取和分离制备高纯度河豚毒素（tetrodotoxin,简称TTX）的方法；其包括以下步骤：将干净的河豚内脏加酸性醇匀浆、加入一定量的助流动剂搅拌均匀后，按柱层析的装柱方法将材料装入层析柱中；用同一酸性醇将河豚内脏中的TTX完全洗脱出来，收集洗脱液为TTX提取液；提取液减压浓缩至水相，得到TTX提取浓缩液；TTX水溶液用离子交换树脂柱层析分离，收集含TTX高的洗脱液，用纳滤膜浓缩或减压蒸干，得到TTX粗品；TTX粗品通过溶剂沉淀和结晶，得到纯度达于98%的TTX；本发明的制备TTX的方法和所用设备简单，TTX提取和分离纯化的得率高、制备成本低，适合TTX的规模化生产；同时该方法使用的有机溶剂可全部回收重复使用，无有害溶剂和废弃物排放，是理想的安全环保的制备TTX方法。

技术领域

本发明涉及一种动物体内生物活性物质的提取和分离纯化技术领域，尤其涉及河豚内脏中河豚素的制备方法。

背景技术

河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX）最初是从河豚鱼（pufferfish, Lagocephalus sceleratus）中提取的小分子非蛋白生物碱类强神经毒素。1909年，日本学者Tawara首次从河豚鱼卵巢中提取出粗毒素并命名（Bane et al., 2014）1950年Yokoo首次从红鳍东方豚卵巢中获得纯化的TTX 结晶(Yokoo, 1950)。1964年，TTX的分子式（C₁₁H₁₇N₃O₈）和化学结构得以确定(Buchwald et al., 1964; Woodward and Gougoutas, 1964; Tsuda and Ikumaet al., 1964)。在很长一段时间里，河豚毒素被认为是河豚鱼体内特有的毒性物质，直到1964年，美国科学家Mosher等从加利福尼亚蝾螈 (Taricha torosa) 中分离得到TTX(Mosher et al., 1964)，才改变了这一说法。迄今的研究表明，TTX不仅存在于多种河豚鱼体内，还广泛存在于近140种动物中，包括脊椎动物和无脊椎动物(Lorentz et al.,1016)，如虾虎鱼(朱国萍等，2015)、蝾螈（Yotsu-Yamashita et al., 2012）、双壳类和腹足类(Laura et al., 2019)、蓝环章鱼(Whitelaw et al., 2019)、纽虫(Vlasenko et al.,2018)、线虫(毛婕，等，2020)等. 而且已经发现多种微生物可产生TTX（Chau et al.，2011；Magarlamov et al. 2017）。

TTX是已知的毒性最强的神经毒素之一，它对人类的毒性是氰化物的1200倍左右，而且没有已知的解毒剂（Lago et al.，2015）。TTX对小鼠的LD₅₀值为10 μg/kg（腹膜内）、16μg/kg（皮下）和332 μg/kg（口服)（Kao，1966）。人体摄入TTX后，中毒症状的严重程度与剂量有关（Homaira et al.，2010）。最初症状包括舌头和嘴唇发麻（感觉异常），然后出现头痛或呕吐，并可能发展为肌肉无力和共济失调。在严重的情况下，可能由于呼吸或心力衰竭而导致死亡（Noguchi and Eebesu，2001）。TTX对人的致死剂量是1.33μg/kg（Kasteel andwesterink，2017）。TTX通过生物链传递和大量海洋与淡水养殖动物中含有TTX等问题，导致人们对环境的安全的忧虑和重视。