[发明专利]一种同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和3型病毒的实时荧光RAA引物和探针、包括所述引物和探针的试剂盒及用途。本发明方法敏感性为10²拷贝/反应，每个反应可同时最低检测出10²拷贝的猪圆环病毒2型和10²拷贝的猪圆环病毒3型病毒。本发明能快捷、高效、灵敏的同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒，为两者的混合感染的快速鉴别检测提供了有效技术手段。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是生物医学的预防兽医学检验领域，具体涉及一种同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒是影响我国以及全球养猪业的两种重要病原。PCV2与PCV3基因组结构类似，主要包括Rep和Cap两个主要蛋白，但两者Cap蛋白的同源性仅为36％～37％。猪圆环病毒2型具有较强的致病性，多感染5～12周龄仔猪，引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征、PCV2相关性肺炎、繁殖障碍和肠炎等，死亡率较高。猪圆环病毒3型PCV3是2016年新发现的病毒，可引起猪皮炎与肾病综合征(PDNS)，临床表现包括母猪流产、仔猪腹泻和胎儿死亡、皮炎等多种症状。目前，我国多个省份(安徽、福建、河北、湖北、江西、广东和浙江等)的猪场相继发现PCV3感染猪群的现象，已对养猪业带来较大损失，并有加剧的趋势。

PCV2和PCV3两者经常混合感染，相互增强毒力，造成感染猪群免疫抑制，使感染猪场的防控与防治更加复杂与困难，从而严重影响养猪场的生产效率。目前，对PCV2和PCV3检测技术主要是血清学技术、普通PCR方法和荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，且一般都是针对单个病原，无法同时鉴别检测两种病毒，导致它们的实际应用范围严重受限。因此，及时建立一种简单、快速、适合现场应用，能同时鉴别检测这两种病原的新型快速检测方法十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的并能同时鉴定猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的检测方法及试剂盒。为了实现上述目的，本发明人分别针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒设计引物和探针，共设计出多条引物和探针，通过交叉反应，筛选出最佳的引物和探针组合应用于本发明。

第一个目的是提供用于鉴别检测PCV2和PCV3的引物，包括正向引物和反向引物，共四条。所述引物根据PCV2和PCV3的保守基因设计，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定PCV2和PCV3基因的保守区。PCV2保守区域为Cap基因组(MH931449.1)的一段序列，含有758个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；PCV3保守区域为Cap基因组(KY075986.1)的一段序列，含有678个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。本发明从分别从SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8序列内筛选设计特异性引物。筛选的引物包括正向引物和反向引物，引物长度为30bp左右。

本发明在第一方面是提供了一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：

序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物，

序列如SEQ ID NO.2所示的第二引物，

序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，

其中，所述第一引物和所述第二引物组成引物对；

序列如SEQ ID NO.4所示的第三引物，

序列如SEQ ID NO.5所示的第四引物，

序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针，

其中，所述第三引物和所述第四引物组成引物对。