[发明专利]基于抗原识别及上转换荧光FRET猝灭的冠状病毒检测试纸的制备方法和使用方法

权利要求书

1.基于抗原识别及上转换荧光FRET猝灭的冠状病毒检测试纸的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：

一、金纳米颗粒溶液的制备：

①、种子液的制备：在温度为26℃～28℃的条件下，将去离子水和CTAB溶液混合，然后以加入速度为0.5mL/s～1mL/s，加入HAuCl₄溶液，在温度为26℃～28℃及搅拌速度为50rpm～60rpm的条件下，搅拌10s～20s，再加入冰浴NaBH₄溶液，在温度为26℃～28℃及搅拌速度为50rpm～60rpm的条件下，搅拌100s～120s，得到种子液；

步骤一①中所述的CTAB溶液的浓度为0.1mol/L～0.3mol/L；步骤一①中所述的HAuCl₄溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；所述的NaBH₄溶液的浓度为0.01mol/L～0.015mol/L；所述的去离子水与步骤一①中所述的CTAB溶液的体积比为1:(0.8～0.99)；所述的去离子水与步骤一①中所述的HAuCl₄溶液的体积比为1:(0.04～0.06)；所述去离子水与NaBH₄溶液的体积比为1:(0.08～0.099)；

②、生长液的制备：在磁力搅拌速度为20rpm～30rpm的条件下，将Milli-Q水和CTAB溶液混合，然后依次加入HAuCl₄溶液和AgNO₃溶液，在磁力搅拌速度为20rpm～30rpm的条件下，搅拌8min～12min，最后加入抗坏血酸，溶液颜色由黄色瞬间变为无色，得到生长液；

步骤一②中所述的CTAB溶液的浓度为0.1mol/L～0.3mol/L；步骤一②中所述的HAuCl₄溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；所述的AgNO₃溶液的浓度为3mmol/L～5mmol/L；所述的抗坏血酸的浓度为0.07mol/L～0.08mol/L；所述的Milli-Q水与步骤一②中所述的CTAB溶液的体积比为1:(1.5～1.8)；所述的Milli-Q水与步骤一②中所述的HAuCl₄溶液的体积比为1:(0.15～0.2)；所述的Milli-Q水与AgNO₃溶液的体积比为1:(0.025～0.035)；所述的Milli-Q水与抗坏血酸的体积比为1:(0.02～0.028)；

③、将种子液加入到生长液中，在温度为26℃～28℃的条件下，静置10h～14h，然后洗涤得到AuNPs，并分散于Milli-Q水中，得到金纳米颗粒溶液；

所述的种子液与生长液的体积比为1:(700～1000)；所述的金纳米颗粒溶液中AuNPs颗粒的浓度为4mg/mL～7mg/mL；

二、Yb³⁺和Er³⁺掺杂的NaGdF₄上转换纳米粒子的制备：

①、将GdCl₃和油酸钠，加入到蒸馏水、无水乙醇以及正己烷的混合溶剂中，在温度为60℃～80℃的水浴及磁力搅拌转速为50rpm～80rpm的条件下，搅拌4h～4.5h，反应结束后，冷却至室温，将产物倒入分液漏斗中，洗涤，保留上层液体，将上层液体烘干，得到含有Gd的油酸盐前驱体；

所述的GdCl₃与步骤二①中所述的油酸钠的质量比为1:(2.5～3.5)；所述的GdCl₃的质量与步骤二①中所述的蒸馏水的体积比为1g:(5～6)mL；所述的GdCl₃的质量与步骤二①中所述的无水乙醇的体积比为1g:(7～8)mL；所述的GdCl₃的质量与步骤二①中所述的正己烷的体积比为1g:(13～13.5)mL；

②、将YbCl₃和油酸钠，加入到蒸馏水、无水乙醇以及正己烷的混合溶剂中，在温度为60℃～80℃的水浴及磁力搅拌转速为50rpm～80rpm的条件下，搅拌4h～4.5h，反应结束后，冷却至室温，将产物倒入分液漏斗中，洗涤，保留上层液体，将上层液体烘干，得到含有Yb的油酸盐前驱体；

所述的YbCl₃与步骤二②中所述的油酸钠的质量比为1:(2.5～3.5)；所述的YbCl₃的质量与步骤二②中所述的蒸馏水的体积比为1g:(4.8～5.8)mL；所述的YbCl₃的质量与步骤二②中所述的无水乙醇的体积比为1g:(6.5～7.5)mL；所述的YbCl₃的质量与步骤二②中所述的正己烷的体积比为1g:(12～13)mL；

③、将ErCl₃和油酸钠，加入到蒸馏水、无水乙醇以及正己烷的混合溶剂中，在温度为60℃～80℃的水浴及磁力搅拌转速为50rpm～80rpm的条件下，搅拌4h～4.5h，反应结束后，冷却至室温，将产物倒入分液漏斗中，洗涤，保留上层液体，将上层液体烘干，得到含有Er的油酸盐前驱体；

所述的ErCl₃与步骤二③中所述的油酸钠的质量比为1:(2.5～3.5)；所述的ErCl₃的质量与步骤二③中所述的蒸馏水体积比为1g:(5～6)mL；所述的ErCl₃的质量与步骤二③中所述的无水乙醇体积比为1g:(6.8～7.8)mL；所述的ErCl₃的质量与步骤二③中所述的正己烷体积比为1g:(12.3～13.3)mL；

④、UCNPs的制备：

将含有Gd的油酸盐前驱体、含有Yb的油酸盐前驱体、含有Er的油酸盐前驱体以及氟化钠混合，加入油酸和十八烯，抽真空，在磁力搅拌转速为50rpm～60rpm的条件下，梯度升温，升温梯度为7℃～13℃，直至升温至100℃～120℃，然后在磁力搅拌转速为50rpm～60rpm及温度为100℃～120℃的条件下，反应30min～40min，反应后关闭真空装置，通入N₂，升温至300℃～320℃，在磁力搅拌速度为50rpm～60rpm及温度为300℃～320℃的条件下，搅拌2h～3h，随后自然冷却至室温，洗涤，最后保存在THF中，得到UCNPs溶液；

所述的含有Gd的油酸盐前驱体与含有Yb的油酸盐前驱体的质量比为1:(1.5～2.5)；所述的含有Gd的油酸盐前驱体与含有Er的油酸盐前驱体的质量比为1:(0.025～0.035)；所述的含有Gd的油酸盐前驱体与氟化钠的质量比为1:(0.52～0.72)；所述的含有Gd的油酸盐前驱体的质量与油酸的体积比为1g:(40～50)mL；所述的含有Gd的油酸盐前驱体的质量与十八烯的体积比为1g:(40～50)mL；所述的UCNPs溶液的浓度为0.05mmol/mL～0.15mmol/mL；

⑤、UCNPs-PEG的合成：

将UCNPs溶液和HS-PEG₁₀₀₀-OCH₃混合，加入DMPA的THF溶液，在冰浴、磁力搅拌速度为50rpm～60rpm、功率为1000W及波长为365nm的紫外光下，照射4次～6次，每次照射50min～70min，然后离心并洗涤，得到Yb³⁺和Er³⁺掺杂的NaGdF₄上转换纳米粒子，即UCNPs-PEG；

所述的UCNPs溶液的体积与HS-PEG₁₀₀₀-OCH₃的质量比为1mL:(0.05～0.15)g；所述的UCNPs溶液与DMPA的THF溶液的体积比为1:(0.02～0.07)；所述的DMPA的THF溶液中DMPA的浓度为80mg/mL～120mg/mL；

三、UCNPs-抗原的制备：

将UCNPs-PEG溶解于水中，得到UCNPs-PEG溶液，向UCNPs-PEG溶液中加入K₂CO₃溶液直至pH值为8～9，加入ACE2抗原，搅拌20s～40s，然后在温度为35℃～40℃的条件下，震荡20min～25min，再加入BSA溶液和PEG-20000溶液，在温度为100℃～120℃的条件下，震荡孵育10min～20min，然后离心，再分散于含有BSA的PBS缓冲溶液中，得到UCNPs-抗原溶液；

所述的UCNPs-PEG溶液的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL；步骤三中所述的BSA溶液的质量百分数为9％～11％；步骤三中所述的PEG-20000溶液的质量百分数为0.5％～1.5％；所述的UCNPs-抗原溶液的浓度为4μg/mL～6μg/mL；

所述的UCNPs-PEG溶液的体积与ACE2抗原的质量比为1mL:(4～6)μg；所述的UCNPs-PEG溶液与步骤三中所述的BSA溶液的体积比为1mL:(90～110)μL；所述的UCNPs-PEG溶液与步骤三中所述的PEG-20000溶液的体积比为1mL:(90～110)μL；

四、AuNPs-抗体的制备：

向金纳米颗粒溶液中加入K₂CO₃溶液直至pH值为8～9，加入ACE2抗体，搅拌20s～40s，然后在温度为35℃～40℃的条件下，震荡15min～25min，再加入BSA溶液和PEG-20000溶液，在温度为100℃～120℃的条件下，震荡孵育10min～20min，然后离心，再分散于含有BSA的PBS缓冲溶液中，得到AuNPs-抗体溶液；

步骤四中所述的BSA溶液的质量百分数为9％～11％；步骤四中所述的PEG-20000溶液的质量百分数为0.5％～1.5％；所述的AuNPs-抗体溶液的浓度为4μg/mL～6μg/mL；

所述的金纳米颗粒溶液的体积与ACE2抗体的质量比为1mL:(4～6)μg；所述的金纳米颗粒溶液与步骤四中所述的BSA溶液的体积比为1mL:(90～110)μL；所述的金纳米颗粒溶液与步骤四中所述的PEG-20000溶液的体积比为1mL:(90～110)μL；

五、试纸条的组装：

①、样品垫处理：

将硝酸纤维素膜在样品垫处理液中浸泡15min～25min，然后烘干，得到样品垫(2)；

②、结合垫的处理：

将玻璃纤维素膜在结合垫处理液中浸泡20h～30h，然后烘干，再放入AuNPs-抗体溶液中浸泡8min～12min，得到捕捉区，然后烘干，得到结合垫(3)；

③、硝酸纤维素膜的处理：

利用UCNPs-抗原溶液在硝酸纤维素膜某一区域以1μL/cm～2μL/cm的参数划线，然后烘干，得到检测T线，在检测T线靠近吸水纸(5)的一侧用包被有兔抗鼠IgG抗体作质控C线，质控C线与结合垫(3)之间的区域及质控C线为检测区，质控C线与吸水纸(5)之间的区域为对比区，得到硝酸纤维素膜层(4)；

④、试纸条的组装：

在底板(1)上表面从左到右依次粘接样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜层(4)及吸水纸(5)，得到基于抗原识别及上转换荧光FRET猝灭的冠状病毒检测试纸。