[发明专利]一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法和定量检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法和定量检测试剂盒及其应用。本发明的定量检测方法包括：提取待检样品中的总RNA，总RNA反转录成cDNA，cDNA进行荧光定量PCR扩增后检测Ct值，将Ct值代入预先拟合的标准曲线方程中，从而计算出样品中抗辐射不动杆菌的数量。本发明的试剂盒包括RNA提取试剂、RNA反转录试剂、PCR扩增反应试剂、扩增抗辐射不动杆菌的特异性引物对以及PCR定量外标准品。本发明的检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高和成本低等特点。

技术领域

本发明涉及一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法和定量检测试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

皮肤作为与外界环境的界面，是抵御病原体入侵的重要屏障。皮肤表面聚集着各种微生物：细菌、真菌和病毒。皮肤微生物在表皮所接触的外环境影响下，形成了其独特且复杂的菌群结构。从生物多样性的角度来说，痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌、马拉色菌等微生物共同组成皮肤微生物的多样性。这些微生物大多是共生体，与入侵病原微生物相竞争。在某些情况下，某一类微生物菌群过度繁殖或者过度缺乏，都会导致皮肤微生态失衡，引起皮肤疾病，包括特应性皮炎、痤疮等。随着分子生物学方法的发展以及PCR技术的出现，以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，许多非培养方式鉴定技术被用于皮肤微生物的鉴定。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量细菌菌株的基因组图谱已被解析出来。这些基因组数据可以使我们了解不同皮肤微生物的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为同种细菌不同菌株间的区分和鉴定奠定了基础。

不动杆菌属是皮肤上主要微生物之一，在自然界中广泛存在，能从土壤、皮肤、环境中富集、分离，发酵代谢产物及其菌种自身应用广泛。测试发现，不动杆菌属确实与皮肤表型或者皮肤微环境相关。不动杆菌属可分为鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌、约翰逊不动杆菌和抗辐射不动杆菌。

目前，不动杆菌属的许多种类其菌落形态、菌体特征相似难辨，生理生化特性也存在许多相似之处，传统的生理生化检测实验存在耗时费力，检测成本高等技术问题，不能满足快速、准确、低成本检测抗辐射不动杆菌检测的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：传统的生理生化检测抗辐射不动杆菌的方法耗时费力以及检测成本高，不能满足快速、准确、低成本检测抗辐射不动杆菌的需要等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测样品中的总RNA；

步骤2：将提取的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用扩增抗辐射不动杆菌的特异性引物对进行荧光定量PCR扩增得到PCR扩增产物；

步骤3：测出PCR扩增产物的Ct值，将Ct值代入预先拟合的标准曲线方程中，从而计算出样品中抗辐射不动杆菌的数量。

优选地，所述步骤1中提取待测样品中的总RNA为采用Trizol试剂盒进行提取。

优选地，所述步骤2中的将提取的总RNA反转录成cDNA采用的是 M-MLV RTasecDNA Synthesis Kit反转录试剂盒。

优选地，所述步骤2中的扩增抗辐射不动杆菌的特异性引物对包括序列如 SEQ IDNo:l所示的上游引物和序列如SEQ ID No:2所示的下游引物。

优选地，所述步骤2中的荧光定量PCR扩增的反应体系包括 1×SYBR Premix ExTaq^TM 5μL，0.2μmol/L上、下游引物各2.5μL，1.0ng/μL的 cDNA模板1.0μL，用ddH2O补足至25.0μL；