[发明专利]基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法

说明书

一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8‑羟基‑2'‑脱氧鸟苷的方法，通过柠檬酸钠还原三水合四氯金酸制备金纳米颗粒(AuNPs)，在碱性条件下将8‑OHdG抗体(Ab)包被于金纳米颗粒的外层形成Ab@AuNPs作为探针。将牛血清蛋白(BSA)与8‑OHdG用碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联制备人工抗原，并包被于硝酸纤维素膜上形成检测线(T线)，将羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线(C线)。由于待测物中的8‑OHdG与检测线上包被的人工抗原竞争8‑OHdG抗体，可以通过检测线颜色的变浅变化检测8‑OHdG，肉眼检测限为50mg/L。本发明可以简单、快速、灵敏地检测8‑OHdG。

技术领域

本发明涉及一种8-羟基-2’-脱氧鸟苷的检测技术方法，尤其涉及一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法。

背景技术

活性氧自由基(ROS)可以诱导动物和人类的DNA氧化损伤，形成大量的DNA损伤产物。食品中存在的邻苯二甲酸盐、重金属、防腐剂、农兽药残留等，可以使人体细胞中的ROS水平升高。另外，外源性活性氧也会造成DNA氧化损伤，如吸烟、紫外线辐射和电离辐射。8-OHdG是研究最多的DNA氧化损伤产物，被公认为氧化应激合适的生物标志物。8-OHdG具有与任何碱基配对的能力，在DNA复制时会引起基因突变和癌基因的表达。

目前，常用的8-OHdG检测方法主要有酶联免疫吸附分析(ELISA)、毛细管电泳(CE)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)等。虽然这些传统的检测技术已经具备优良的选择性以及合适的检测限，但是大多存在仪器昂贵、样品前处理繁琐、操作过程复杂等问题。近年来，由于免疫层析法具有快速、简单、经济、准确等诸多优点，在许多领域被广泛使用，无需特殊设备和复杂的技术。免疫层析结合比色法可以通过简单的颜色变化监测待测物的存在，但是比色分析灵敏度不高，通过与不同种类的纳米材料结合可以提高检测灵敏性和选择性。常用的纳米材料包括碳纳米材料、金属纳米材料、二氧化硅纳米颗粒和量子点。胶体金(AuNPs)合成简单，得到的产物也很稳定，并且金纳米颗粒具有强烈的红色，结合金纳米颗粒构建免疫层析试纸可以实现更加简单、快速的8-OHdG检测。

发明内容

为了克服已有8-OHdG检测方法的速度较慢、操作复杂、成本昂贵等不足，本发明提供了一种简单、快速、灵敏的基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，所述方法包括以下步骤：

1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体的体积比为10:1～2:1,制得的金标抗体在4℃下保存备用；

2)8-OHdG完全抗原制备：配置8-OHdG溶液、牛血清蛋白BSA溶液和碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50:5:1～10:5:1；室温反应1.5～2.5h后，用500MW的透析膜和500mL 1×PBS透析过夜，于4℃下保存备用；

3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(6)和PVC底板(7),将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(5)和吸水垫(6)依此粘贴在PVC底板(7)上，相互之间重叠1-2mm；在结合垫上喷涂步骤1)制备好的金标抗体，在硝酸纤维素膜上以0.5～1.5μL/cm的量喷涂步骤2)制备好的8-OHdG完全抗原与羊抗鼠IgG，分别为检测线和质控线，干燥20～40min；将干燥后的试纸切成3～6mm宽的试纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；