[发明专利]一种采用血管紧张素转化酶II(ACE2)检测冠状病毒的方法

说明书

本发明涉及到利用配体‑受体相互作用，即冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与血管紧张素转化酶II(ACE2)的强结合作用，对冠状病毒颗粒以及其刺突蛋白或者任何含RBD的刺突蛋白片段进行检测或定量分析的方法。作为传统免疫分析方法中所必须的抗体的替代物，ACE2可用于包被固相表面以捕获或富集被测物，它也可以与参与信号产生的标记物相偶联。取决于被测物性质和信号模式，ACE2可以单独作为被测物识别体使用，也可以与抗体联合使用。

技术领域

本发明属于冠状病毒检测方法领域。

背景技术

SARS-CoV-2的包膜直径约85纳米，其冠状刺突蛋白(Spike蛋白，简称为S 蛋白，见图1)约20纳米长。大量的研究已经证明，SARS-CoV-2与SARS的病原体SARS-CoV一样，是通过S蛋白结合相同的受体-血管紧张素转化酶II(ACE2)，并在跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)的协助下，而入侵人体细胞的。S蛋白是个三聚体，由S1和S2两个亚基组成。S1亚基形成冠状刺突的顶部，而S2亚基锚定 (anchored)在病毒包膜上。S1亚基上的受体结合域RBD(receptorbinding domain， RBD，见图1右边)与人体细胞表面受体ACE2结合后，由于蛋白酶TMPRSS2的作用，S蛋白的特定位点被切开，导致病毒包膜与细胞膜的融合，从而让病毒进入细胞，受体结合域RBD由223个氨基酸组成，分子量为25kDa。

ACE2由805个氨基酸组成，其分子量为91kDa。它在人体的几乎所有器官,如口鼻粘膜、鼻咽、肺、胃、小肠、结肠、皮肤、淋巴结、胸腺、骨髓、脾、肝、肾、脑以及睾丸等的内皮细胞和平滑肌细胞上均有表达，并在肺部组织和小肠组织表达最丰富。ACE2 可以从细胞表面裂解，以可溶性酶的形式存在于人体内，但可溶性ACE2的生理意义目前尚不清楚。2003年SARS发生后，ACE2被确认为SARS-CoV进入人体并进攻人体其它器官的靶点。SARS-CoV-2的基因序列与SARS-CoV有较高的相似度，但就配体-受体结合能力讲，SARS-CoV-2和SARS-CoV有所不同。对SARS-CoV-2的RBD与ACE2的结合动力学研究表明，其与ACE2结合的平衡解离常数为K_D＝4.674×10^-9M或14.7×10^-9M。这一量级的平衡解离常数表明SARS-CoV-2与ACE2的结合能力比SARS-CoV与ACE2 的结合约强十倍。这一超强的配体(RBD)-受体(ACE2)结合能力从一定程度地解释了 SARS-CoV-2的更快速传播和更大的危害。另一方面，这一超强的配体-受体结合能力也为病毒检测和COVID-19的诊断和预后提供了新的思路。

自COVID-19爆发以来，用于COVID-19病原学诊断的技术手段是基于病毒的核酸检测和人体免疫反应产生的抗体的检测。前者通过咽拭子或鼻拭子采集人体呼吸道(鼻腔或者咽部)分泌物作为样本进行病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序，而后者通过采集血液标本检测血液中由于病毒感染而可能产生的抗体(IgM、IgA和IgG)。由于采样方法、采样时间以及检测技术本身在特异性和敏感性方面的局限，目前任何一种单一检测方法都不能对病毒本身、人体是否感染以及感染后的状况作出全面和百分之百正确的判断，给疾病的防控和病人的预后带来不便。随着感染和病患人数的进一步快速上升以及对 SARS-CoV-2在未来可能与人类长期共存的担忧的加剧，发展多种技术手段进行诊断和分析是一件即紧迫又具有长期价值的事情。

对比针对由病原体引起的传染性疾病的长期实践以及目前面临COVID-19大流行时的应对措施，一个明显的技术短缺是对病毒抗原(antigen)物质(如S蛋白和其片段)以及病毒粒子或病毒体(virion)本身的检测。这种状况与针对SARS-CoV-2的、兼具高亲和性和高选择性的特异性抗体的缺失有关。