[发明专利]用于提取细菌中质粒DNA的方法

说明书

本发明公开了一种用于提取细菌中质粒DNA的方法，属于生物制药技术领域。本发明在两个串联的混合组件中实现质粒生产过程中的裂解和中和，具体包括以下步骤：(1)混合，(2)裂解，(3)中和；其中，步骤(1)在第一混合组件中完成，步骤(2)在裂解螺旋管中完成，步骤(3)在第二混合组件中完成，第一混合组件、裂解螺旋管和第二混合组件依次串联。本发明的质粒制备工艺中的设备简单，操作方便，成本低廉，不需要专业的定制化和价格高昂的设备，可去除细胞裂解过程中的大量杂质，成分安全，实现自动化连续裂解，利于工业化生产。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种用于提取细菌中质粒DNA的方法。

背景技术

近年来，由于基因治疗和DNA疫苗临床上的成功，人们对工业化规模的质粒发酵生产需求已经非常迫切。基因治疗是将外源基因导入靶细胞，在患者细胞中表达基因来治疗或预防疾病，其最终目标是通过添加、纠正或替换基因来治愈遗传和后天疾病。实现这些目标的基因治疗载体主要有两种，即以灭活病毒为基础的病毒载体和以质粒DNA为基础的非病毒载体。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗被称为继灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”，具有广阔的发展前景，而质粒为DNA疫苗的常用载体。所以质粒的大规模生产技术对于基因治疗和DNA疫苗的发展至关重要。

当前规模化质粒的生产技术主要包括以下几道工序：载体构建、细菌发酵、菌体裂解、固液分离及澄清、质粒纯化。虽然目前的质粒生产工艺可以生产出符合药学质量标准的质粒，满足临床要求，但在这些工艺中还存在一些难以克服的瓶颈。如产量规模化(千克级)较难，载体拷贝数、稳定性问题，裂解过程中导致DNA变性、HCD残留去除，固液分离较难，内毒素残留等难题。

用于生物制药的质粒DNA主要在大肠杆菌中生产，碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，利用碱性条件将细胞裂解，同时染色体DNA发生不可逆变性，而质粒DNA在pH恢复中性时可复性的原理，将质粒与染色体DNA分离。质粒制备的第一步也是最关键的一步是细胞裂解，如何将细胞彻底裂解，染色体DNA完全共沉淀，去除大部分的RNA成为细胞裂解的核心问题。目前工业规模的质粒提取工艺存在的主要问题有：1、碱裂解无自动化设备或设备能力满足不了充分混合的要求；2、使用大量有机溶剂及酸液，这在大规模工业化生产中增加安全风险及对厂房设备要求较高；3、使用中和液(溶液Ⅲ)混合后，无自动化的混合设备或混合设备满足不了均匀低剪切的混合要求；4、中和混合液固液分离生产成本较高；5、宿主DNA残留较高；6、RNA去除率较低，影响下游纯化；7、重复用管路设备清洗困难，不利于CIP清洗，而一次性耗材设备成本较高。

中国专利CN111808716A公开了一种质粒提取装置，包括裂解容器、沉淀容器、洗脱液容器、收集容器和层析柱，所述裂解容器与沉淀容器之间通过第一连接管连通，所述沉淀容器与层析柱之间通过第二连接管连通，所述洗脱液容器与层析柱之间通过第三连接管连通，所述第一连接管、第二连接管和第三连接管上均设置有阀门，所述收集容器设置在层析柱的下方，所述层析柱连接有振动机构。上述技术方案采取了振动式结构，加工过程不连续，需要进一步提升加工效率，并且该种方式存在宿主DNA残留较高的问题，还需要进一步改进。

虽然我们为了解决目前大规模生产质粒DNA的方法存在的缺陷，先前研发了一种通过混合腔震荡的方式进行裂解、中和提取细菌中质粒DNA的方法(参见：200610114061.6，一种连续大量提取质粒的方法)，但是其不容易放大，提取的质粒DNA的效率较低；为解决这一问题，我们又研发了通过气泡混合器提取质粒DNA的装置(参见：202011120617.9，用于提取细菌中质粒DNA的气泡发生装置)，其使菌液与裂解液能均一且充分混合，气泡混合有效降低剪切力，有效提高收率与质量，但是其仍存在不太容易放大的问题，需要根据规模定制不同大小的气泡混合器，摸索通气量，流速等放大条件。