[发明专利]多种维生素D代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用

权利要求书

1.检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，所述方法同时检测25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2这六种维生素代谢物，采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有醋酸锂的水溶液，所述流动相B为含有醋酸锂的甲醇溶液；

所述流动相A和所述流动相B中，醋酸锂的浓度为0.18-0.22mM；

所述流动相按照以下梯度进行梯度洗脱：0-0.2min，流动相A 75-78%，0.2-0.3min，流动相A 78-30%，0.3-6.0min，流动相A 30-29%，6.0-9.0min，流动相A 29-28%，9.0-10.0min，流动相A 28-27%，10.0-10.5min，流动相A 27-20%，10.5-12.5min，流动相A 20%，12.5-12.6min，流动相A 20-5%，12.6-13.1min，流动相A 5%，13.1-13.2min，流动相A 5-75%，13.2-14.0min，流动相A 75%；

液相色谱的色谱柱为Ascentis Express F5，2.1 × 100 mm，2.7 μm；

在液相色谱分离前，还包括样品前处理步骤，所述样品前处理包括：将所述样品与内标液和甲醇混合得到第一混合液，再将所述第一混合液与硫酸锌水溶液以及正己烷和乙酸乙酯的混合溶液混合，得到第二混合液，将所述第二混合液的上清与沉淀分离，将所述上清经干燥、复溶后进行液相色谱分离。

2.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，梯度洗脱过程中，所述流动相的流速为0.2-0.6 mL/min。

3.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为20-42℃。

4.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，样品前处理体系中，硫酸锌的终浓度为20-30mM，正己烷和乙酸乙酯的用量分别为样品体积的3-5倍和0.8-1.2倍。

5.根据权利要求4所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，样品前处理体系中，甲醇的用量为样品体积的0.8-1.2倍，内标液的用量为样品体积的20-30%。

6.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，质谱检测条件如下：正离子、点喷雾电离、MRM采集定量离子对，Gas1、Gas2、气帘气和碰撞气分别为60psi，60psi，30 psi和medium，离子喷雾电压为5500v，最佳探针温度为400℃。

7.根据权利要求6所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，所述定量离子对如下：25OHD₃的母离子为m/z 407.4，子离子为m/z 389.3，25OHD₂的母离子为m/z 419.3，子离子为m/z 401.4，1,25(OH)₂D₃的母离子为m/z 423.4，子离子为m/z 387.4，1,25(OH)₂D₂的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 381.4，24,25(OH)₂D₃的母离子为m/z 423.4，子离子为m/z405.4，24,25(OH)₂D₂ 的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 417.4，25OHD₃ -d₃的母离子为m/z 410.4，子离子为m/z 392.3，25OHD₂ -d₃的母离子为m/z 422.3，子离子为m/z 404.4，1,25(OH)₂D₃ -d₃的母离子为m/z 426.3，子离子为m/z 372.4，24,25(OH)₂D₃ -d₆的母离子为m/z429.4，子离子为m/z 411.4。