[发明专利]磷脂酶C突变体、制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种磷脂酶C突变体、制备方法及其应用，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该突变体是将源自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSL3野生型磷脂酶C的第96位苯丙氨酸F突变成精氨酸R；第153位谷氨酰胺Q突变成脯氨酸P。与野生型重组PLC相比，该突变体的热稳定性得到了显著改善，最佳反应温度从80℃提高到90℃，是目前报道的最高反应温度；在该温度下孵育50min仍可保留56％左右的酶活。该突变体的kcat和kcat/Km分别是野生型的5.64倍和2.37倍，且对底物的适应性也有所改善。同源建模分析表明，突变导致无规则卷曲比例下降并抑制了特定loop的活动，从而显著提高突变体的热稳定性和活性。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种磷脂酶C突变体、制备方法及其应用。

背景技术

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC,EC3.1.4.3)是一种专一水解甘油磷脂C3键的水解酶，其水解产物为磷酸单脂和二酰甘油，普遍存在于原核及真核生物中。PLC在抗血小板新药研究、高血压等病理研究以及食品工业添加剂、尤其是植物油脱胶等方面具有广阔的应用前景。目前，从长远角度来看，PLC应用于油脂酶法脱胶最具工业应用前景。用磷脂酶C进行脱胶有很多优点：无副产品，安全性高，脱胶过程中少量的水足以发挥水解作用，避免了水解作用产生大量废水污染环境的问题，提高了脱胶油得率。目前国内尚无商业化的PLC，工业化使用的PLC主要是Novoeymes公司进口酶。

产磷脂酶C的微生物种类较多，易于大规模生产，因此源自微生物的磷脂酶C已成为工业用酶的最主要来源。微生物天然磷脂酶C产量低，纯化步骤繁琐，且细菌性来源的磷脂酶C大多是毒力因子，在生产应用中存在安全隐患。重组磷脂酶C由遗传背景清楚的大肠杆菌表达，在工业应用中不存在安全问题。利用大肠杆菌大量发酵可提高磷脂酶C的产量，为满足工业生产奠定良好基础。但目前微生物重组PLC存在活性低，特别是热稳定性较差等问题。目前已报道的PLC最佳酶活温度在40-70℃左右。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种磷脂酶C突变体，其具有较好的热稳定性和催化效率。

为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种磷脂酶C突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明的实施例，所述突变体是将野生型磷脂酶C的第96位苯丙氨酸F突变成精氨酸R；第153位谷氨酰胺Q突变成脯氨酸P。与野生型重组PLC相比，该突变体的热稳定性得到了显著改善，最佳反应温度从80℃提高到90℃，是目前报道的最高反应温度；在该温度下孵育50min仍可保留56％左右的酶活。该突变体的kcat和kcat/Km分别是野生型的5.64倍和2.37倍，且对底物的适应性也有所改善。同源建模分析表明，突变导致无规则卷曲比例下降并抑制了特定loop的活动，从而显著提高突变体的热稳定性和活性。圆二色谱结果显示Helix的增加也进一步从结构上说明了突变体比野生型具有更好的热稳定性和催化效率。

在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述磷脂酶C的突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第三方面中，提供了一种获得上述磷脂酶C突变体的方法，包括：

(1)分析野生型磷脂酶C的B因子值，找出可能显著影响磷脂酶C稳定性的关键氨基酸残基；

(2)分析氨基酸残基的二级结构和结构域进行二次筛选，得候选突变体；

(3)通过短时分子动力学模拟分析候选突变体的结构稳定性，选取均方根偏差和总能量最低的突变体验证；

(4)将步骤(3)选出的突变体的基因克隆入原核表达载体中，构建重组载体；

(5)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得磷脂酶C突变体。