[发明专利]一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法

权利要求书

1.一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应产物并与多肽混合，得到混合液；

(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；

(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；

(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、3CL蛋白酶、Caspase家族蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶或羧肽酶中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磁珠抗体复合物包括磁珠和修饰于所述磁珠表面的抗蛋白酶抗体；

优选地，步骤(1)所述多肽包括所述蛋白酶的特异性酶切位点；

优选地，步骤(1)所述多肽修饰有荧光基团和淬灭基团；

优选地，步骤(1)所述反应的温度为4～37℃；

优选地，步骤(1)所述反应的时间为5～60min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述微阵列微流控芯片包括微阵列层和盖片层；

优选地，所述微阵列层包括20～150万个反应微孔；

优选地，步骤(2)所述孵育的温度为4～37℃；

优选地，步骤(2)所述孵育的时间为0.5～2h；

优选地，步骤(2)还包括向微阵列微流控芯片注入氟油的步骤。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括构建所述百分比和蛋白酶浓度的标准曲线并拟合标准曲线方程。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备磁珠抗体复合物的步骤；

优选地，所述磁珠抗体复合物的制备方法包括以下步骤：

(1’)使用磷酸盐缓冲液清洗磁珠，并将清洗后的磁珠与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合，进行反应，收集磁珠，并使用2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液清洗；

(2’)将步骤(1’)得到的磁珠与抗蛋白酶抗体混合，进行反应，得到所述磁珠抗体复合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为10～30mg/mL；

优选地，步骤(1’)所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10～30mg/mL；

优选地，步骤(1’)所述反应的时间为20～40min；

优选地，步骤(2’)所述反应的时间为30～60min。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备微阵列微流控芯片的步骤；

优选地，所述微阵列微流控芯片的制备方法包括以下步骤：

(1”)将聚二甲基硅氧烷与固化剂混合，并进行除气脱泡处理，得到混合物；

(2”)将所述混合物注入微阵列层模具上，进行固化处理后裁片得到微阵列层；

(3”)将所述混合物注入盖片层模具上，进行固化处理后裁片，得到盖片层；

(4”)对所述微阵列层和盖片层进行等离子处理，将等离子处理后的微阵列层和盖片层叠合，得到所述微阵列微流控芯片。