[发明专利]一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法

说明书

本发明涉及一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法。所述方法包括以下步骤：(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应物并与多肽混合，得到混合液；(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。所述方法可实现蛋白酶高灵敏度检测，且操作简单，标准曲线拟合度高，可准确计算样品中蛋白酶的浓度。

技术领域

本发明属于酶检测技术领域，涉及一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法。

背景技术

蛋白酶(Protease)是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类，内肽酶切割蛋白质或多肽底物分子内部肽键，外肽酶从蛋白质分子游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解；按其活性中心，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶；按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

蛋白酶广泛存在于动植物、微生物和病毒中。蛋白酶对所作用的反应底物具有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中特异的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶在许多生命活动中起到重要作用，例如病毒编码的蛋白酶在许多病毒的复制过程中发挥重要功能，如逆转录病毒HIV-1的逆转录酶、整合酶，黄病毒HCV的NS3/4a蛋白酶，冠状病毒SARS-CoV2的3CL蛋白酶等，这些蛋白酶在病毒结构和非结构蛋白的分离、RNA聚合酶的产生、病毒粒子的组装和成熟中发挥重要作用，且人体内没有同源蛋白，因此是病毒检测和抗病毒药物筛选的理想靶点；再如天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族，是一组在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶。caspase蛋白酶原的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件，激活的caspase裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，细胞凋亡对于及时清除体内多余和受损伤的细胞，维持组织器官的稳定性具有重要作用，在生命科学领域中，通过检测caspase蛋白酶的活性来检测凋亡的细胞。

目前检测蛋白酶活性的原理相似，通常是基于荧光法进行检测。

CN112326620A公开了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，所述方法包括(1)预先设定一份蛋白酶含量值参考表；(2)配置荧光用探针的荧光溶液；(3)根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；(4)创建蛋白酶荧光色参考表；(5)测定样品中是否有蛋白酶；(6)将含有蛋白酶的样品放入到荧光溶液中，进行培养；(7)进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。操作工艺简单，能够快速的发现检测样品中是否有蛋白酶，但检测蛋白酶灵敏度有限，且当样本中蛋白酶浓度较低时，易出现假阴性的结果。

综上所述，提供一种高灵敏度的蛋白酶检测方法，对于蛋白酶检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种超高灵敏度的蛋白酶数字检测方法，所述方法利用微阵列微流控芯片，使得荧光反应在微孔中进行，能够显著提高蛋白酶检测的灵敏度，并缩小反应体积。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种超高灵敏度的蛋白酶数字蛋白酶检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将蛋白酶标准品与磁珠抗体复合物混合，进行反应，收集反应产物并与多肽混合，得到混合液；

(2)将所述混合液注入微阵列微流控芯片，进行孵育，并检测荧光点占总颗粒的百分比；

(3)构建所述百分比和蛋白酶浓度的数学关系；

(4)按步骤(1)和步骤(2)所述检测样本的荧光点占总颗粒的百分比，并利用步骤(3)所述的数学关系计算样本中蛋白酶浓度。