[发明专利]一种分子肽突变体

说明书

本发明公开一种分子肽突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明在不影响异肽键形成的基础上对SpyCatcher进行设计改造得到对pH有刺激响应的分子肽SpyCatcher‑21，并且通过对晶体结构的分析在SpyCatcher‑21的关键loop中引入Pro来降低loop的柔性，获得突变体SpyCatcher‑21_A82P，提高了连接效率，可用于根据客观需要，通过改变环境的pH来得到不同程度的偶联来得到双酶催化；或与带有正电的酶通过静电作用相互作用得到三酶偶联的催化体系。

技术领域

本发明属于分子肽SpyCatcher设计领域，更具体地，涉及一种分子肽突变体。

背景技术

在2010年，英国牛津大学生物化学中心Mark Howarth团队在革兰氏阳性菌酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的菌毛蛋白中分离了可以自发形成异肽键的多肽片段，分别称为SpyTag（13个氨基酸）和SpyCatcher（116个氨基酸），其中SpyTag的Asp117可以和SpyCatcher的Lys31可以自发地脱水形成异肽键。SpyTag/SpyCatcher已经倍广泛的应用在各种领域，比如应用在蛋白纯化领域，蛋白展示系统等。但是原始的分子肽SpyTag/SpyCatcher的反应条件广泛，不具备对外界环境的刺激响应行为。蛋白质表面的电荷密度的改变可以改变酶的许多特性，其中包括聚集抗性，细胞通透性，刺激响应行为，以及与带相反电荷的大分子结合能力。但是，氨基酸突变对于蛋白质来说都是有风险的，在很大一部分情况下经过改造会出现失活的现象，因此对SpyCatcher的改造也有可能导致无法正常与SpyTag形成异肽键，或影响连接效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子肽突变体，在不影响异肽键形成的基础上得到可以对pH有刺激响应的分子肽SpyCatcher-21，并且通过对晶体结构的分析在SpyCatcher-21的关键loop中引入Pro来降低loop的柔性，获得突变体SpyCatcher-21_A82P，在不影响其表面电位的基础上，提高SpyCatcher-21和SpyTag的连接效率。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种分子肽突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的在于保护编码权利要求1所述分子肽的基因序列。

本发明的又一目的在于提供上述分子肽的在双酶或三酶催化体系中的应用。

具体的，可通过改变环境的pH使SpyCatcher-21_A82P和SpyTag不同程度的偶联用于双酶催化；或是与带有正电的酶通过静电作用相互作用得到三酶偶联的催化体系。

本发明的分子肽可通过如下方式纯化，包括：

（1）将分子肽的基因序列导入载体构建重组质粒，重组质粒导入宿主菌；

（2）将含重组质粒的宿主菌培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，之后加入IPTG诱导；

（3）诱导结束后，取菌液离心后收集菌体，加入磷酸缓冲液重悬，超声破碎；

（4）破碎液超速离心后取上清液，纯化透析获取纯化蛋白。

进一步的，所述（1）中，载体选用pET-22b；载体连接的酶切位点为Nde I和Xho I。

进一步的，所述（1）中，宿主菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。

进一步的，所述（2）中，含重组质粒的大肠杆菌在LB培养基中培养。

进一步的，所述（4）中，上清液在Ni-NTA树脂中进行蛋白纯化。