[发明专利]可脱除骨架修饰快速脱除的新方法及应用

说明书

本发明公开了一种可脱除骨架修饰(RBM)快速脱除的新方法及应用，该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法包括以下步骤：将多肽中引入的RBM中的硝基‑NOsubgt;2/subgt;首先还原为氨基‑NHsubgt;2/subgt;，然后在酸性有机溶剂中利用氧化剂将氨基‑NHsubgt;2/subgt;转化为重氮盐‑N≡N，最后利用还原剂脱除重氮盐‑N≡N，从而实现将RBM转化为2‑羟基‑4‑甲氧基苄基(HMB)，从而通过多肽切割试剂将RBM从多肽上快速脱除，另外本发明操作简单、收率高，可将其应用于多肽或蛋白的制备中，能够有效提高多肽的合成产率、辅助蛋白化学连接等，获得天然多肽或蛋白。

技术领域

本发明属于多肽或蛋白合成技术领域，具体涉及一种将多肽序列上可脱除骨架修饰RBM转化为HMB的转化方法，以及采用该转化方法将多肽上可脱除骨架修饰快速脱除的新方法，以及该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法在制备多肽或蛋白中的应用。

背景技术

化学蛋白质合成可以获得具有翻译后修饰或位点特异性标记的蛋白质，虽然这项技术在水溶性球状蛋白的研究中发现了越来越多的应用，但困难序列多肽的化学合成仍然是一项巨大的挑战。具体的说，困难序列多肽难以合成主要是因为它们形成容易聚集的二级结构(α螺旋或β折叠)。为了实现化学合成策略高效获取困难序列蛋白样品，Kent等人在主链骨架N-原子上引入N-甲基化修饰，从而破坏多肽片段的二级结构，有效增加困难序列多肽溶解性，但是该基团无法有效脱除，得不到天然蛋白，没有实用价值。除了引入N-甲基化修饰，在二级结构区域中引入骨架修饰基团，也可以有效地破坏二级结构的形成。1993年Sheppard等研究报道了一种基于骨架酰胺保护的策略，即N-(2-羟基-4-甲氧基苄(Hmb))结构。在标准SPPS条件下，待多肽组装完成后，向树脂中加入三氟乙酸，HMB和其他酸不稳定的保护基都会从多肽序列中脱除，可以获得天然的目标多肽。但HMB只能接入到Gly上，且并不是所有的困难序列多肽在其易形成二级结构的区域都含有Gly，这使得基于Gly位点引入HMB策略在实际应用中受到了极大地限制。

随后2016年新的研究发现可在任意氨基酸位点引入可脱除骨架修饰(RemovableBackbone Modification,RBM)策略。该策略采用活化的O-N酰基转移辅助装置，在Fmoc固相肽合成过程中安装一个对三氟乙酸具有可切换反应性的RBM(可移除的骨架修饰)基团，即2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛，该基团与Fmoc SPPS兼容，在肽片段合成及多肽连接中稳定。RBM显著的优点是可以安装在任意氨基酸上，从而可以不受限制的用于模型肽或困难序列多肽合成，并且困难序列多肽及其片段表现得几乎像是水溶性肽，在连接、纯化和质量表征的过程中可以很容易地处理。此外，RBM基团可以被三氟乙酸定量去除，得到天然蛋白质。

虽然RBM基团可以被多肽切割试剂定量去除，但RBM脱除速率与安装位点有关，比如安装在丙氨酸后的RBM可以较快去除，但对于另外一些氨基酸位点多肽切割试剂(如三氟乙酸)切除可脱除骨架修饰RBM通常需要5h左右，时间较长，长时间的脱除过程可能会使多肽蛋白发生一些副反应，比如三氟乙酸化或带上三氟乙酸盐，因此需要开发将RBM快速脱除的方法。

经研究发现，多肽序列上的RBM在TFA等多肽切割试剂中脱除缓慢，主要是由于RBM的苯环上存在硝基这样的吸电子基团，若将RBM上的硝基脱除即将其转化为对TFA异常敏感Hmb结构，则多肽序列上的RBM能够轻松脱除，但在化学合成蛋白中直接脱除RBM上的硝基是非常困难的。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种可脱除骨架修饰快速脱除的新方法及应用，通过将RBM上的硝基脱除，将其转化为对三氟乙酸异常敏感的HMB(2-羟基-4-甲氧基苄基)结构，从而进一步的使得多肽序列上的RBM能够轻松快速脱除，该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法的操作简单且收率高，可将其应用于多肽或蛋白的制备中，有效提高困难多肽的合成产率、辅助蛋白化学连接等，获得天然多肽或蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种转化方法，包括以下步骤：