[发明专利]一种有效抑制干细胞分化的无血清、无饲养层培养基及培养方法

说明书

本发明涉及一种有效抑制干细胞分化的无血清、无饲养层培养基及培养方法。也涉及维持于未分化状态的干细胞。以前培养人胚胎干细胞的培养需要饲养层细胞和含血清的培养基以将干细胞维持在未分化状态。本发明发现，如果在培养干细胞的培养基中加入TGF‑β和Activin，不需要饲养细胞和血清，干细胞也能在至少10次传代中无限期地维持未分化状态。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种有效抑制干细胞分化的无血清、无饲养层培养基及培养方法。

背景技术

在成体动物中许多组织如皮肤、血液和小肠上皮的细胞寿命很短，需要不断地被相应的新细胞替换。成熟个体产生新的分化细胞的途径之一是通过已存在的分化细胞的简单倍增形成新的分化细胞，即分化细胞经分裂形成相同类型的两个子代细胞，如血管中新的内皮细胞就是通过这种方式产生的。但是，在分化的过程中，细胞往往因为高度分化而失去了再分裂的能力，最终走向衰老死亡。为了弥补这一不足，机体在发育过程中还保留了一部分未分化的原始细胞，也就是干细胞。一旦生理需要，这些干细胞可以按照发育途径通过分裂产生分化细胞。

干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。简单来讲，干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。

人胚胎干细胞(hESCs)是从胚泡期分离培养出来的多能细胞，胚胎起源赋予了hESCs在体外无限增殖的能力，同时保持向外胚层、中胚层和内胚层分化的能力。虽然hESCs细胞具有无限的自我更新潜力，但在培养过程中容易自然分化，严重影响干细胞的质量。理解分子机制和识别在早期阶段抑制分化的因素是维持未分化干细胞的必要条件。

研究表明，hESCs使用不同的信号通路来维持其多能性，hESCs 关键多能性因子调控因子Nanog参与细胞内质量控制，并维持胚胎干细胞的增殖和自我更新。Nanog限制Smad2/3级联反应的转录活性，阻止其向胚外内胚层和滋养外胚层分化。Nanog的下调导致hESCs 多能性丧失，经多次传代后表达外胚层和内胚层标记物。而且Nanog 的下调还导致Oct4的显著下调和hESCs表面抗原的丢失，这与多能性的丧失一致。

hES细胞的培养基一般为DMEM/F12，添加血清替代物(serum replacement，SR)、2-巯基乙醇、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、谷氨酰胺、非必需氨基酸，根据饲养层的有无可以分为含饲养层和无饲养层体系两种。自Thomson等使用丝裂霉素C或γ射线灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)作为饲养层成功建系以来，含饲养层培养体系一直被大多数研究人员所接受，至今仍是hES细胞培养最常见的体系。这种体系中培养的hES细胞状态比较稳定，但MEF在体外培养代次有限(一般为8代左右，饲养层常用第4代左右)，人力物力耗费大，且是鼠源物质给hES细胞的临床应用带来安全隐患。为避免异源污染，韩国学者用人羊水细胞(human amniotic fluidcells，HAF)作为饲养层，并用SR代替血清培养hES细胞，这一研究使hES细胞摆脱动物源污染。除此之外，研究人员还用羊水间充质干细胞、骨髓间充质细胞、毛囊间充质、成纤维细胞作为饲养层，为临床应用奠定基础。尽管饲养层培养体系较为成熟，但这个体系仍然存在很多无法克服的缺点，如饲养层取材不便，制备繁琐，批次间差异较大，分享纯化困难，具有异源污染，易引发免疫反应等，饲养层细胞的质量及培养条件的一致性对于产生高质量性能稳定的hES细胞起到关键性作用，大大限制了hES细胞的临床应用。