[发明专利]猪圆环病毒2b亚型自身表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的构建方法和应用

权利要求书

1.用于构建基于猪圆环病毒2b亚型病毒样颗粒的引物，其特征是：所述引物为该病毒蛋白C端连接中和表位的重组CapE2基因的引物，引物序列如下：

cap-F：GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGT；

capE2-R：

AAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTC。

2.一种如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)目的基因的扩增

利用权利要求1所述的引物cap-F和capE2-R，对原始Cap基因和构建的C端重复串联两个中和表位²²⁶LKDPPLNP²³³的重组CapE2基因进行扩增，得到目的基因扩增产物；

(2)重组表达载体的构建

将目的基因扩增产物进行琼脂糖凝胶分离，对目的基因条带与pFastBac^TMI载体的BamHI和HindIII两个位点进行双酶切，酶切后的产物与T4 DNA连接酶于4℃过夜反应，得到连接产物；将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素抗生素的LB平板，获得阳性菌落，从菌液中提取重组质粒pFastBac^TMI-CapE2转化入DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得阳性菌；利用质粒提取试剂盒对阳性菌提取得到重组杆粒Bac-CapE2；

(3)重组蛋白的表达

将上述步骤获得的重组杆粒Bac-CapE2转染sf21细胞，收集上清病毒液，培养四代后，得到CapE2蛋白；

(4)重组蛋白的纯化

利用蔗糖密度梯度离心对CapE2蛋白进行纯化，并进一步以动态光散射及透射电镜对得到的纯化蛋白进行鉴定，得到猪圆环病毒2b亚型病毒样颗粒。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：扩增时的PCR条件为：98℃预变性1min，98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：

将目的基因扩增产物进行琼脂糖凝胶分离，对目的基因条带与pFastBac^TMI载体的BamHI和HindIII两个位点进行双酶切，酶切后的产物与T4 DNA连接酶混合，于4℃过夜反应，得到连接产物；取10μL连接产物与DH5α感受态细胞混合均匀，冰浴30min后热激90s，再次冰浴3min后加入1mL无抗生素的液体LB培养基，置于37℃220rpm震荡培养1h；之后，将转化产物涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素抗生素的固体LB培养基平板上，挑选阳性菌落扩大培养，并提取重组质粒；

将阳性重组质粒pFastBac^TMI-CapE2与DH10Bac感受态细胞混合均匀，冰浴30min后热激90s，再次冰浴5min后加入1mL无抗生素的液体LB培养基，置于37℃220rpm震荡培养4h；3000rpm离心90s后，将转化产物涂布到含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL四环素、10μg/mL庆大霉素的三种抗生素的固体LB培养基平板上，进行蓝白斑筛选，挑取3～5个白色菌落，加入含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL四环素、10μg/mL庆大霉素的三种抗生素的液体LB培养基中，37℃220rpm摇床过夜培养，得到阳性菌；利用质粒提取试剂盒对阳性菌进行提取，最终得到重组杆粒Bac-CapE2。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述液体LB培养基的制备方法为：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g，混合后加入800mL去离子水，充分搅拌，用NaOH调节PH至7.4，用去离子水定容至1L，经高压蒸汽灭菌即得；

固体LB培养基的制备方法为：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、琼脂糖15g，混合后加入800mL去离子水，充分搅拌，用NaOH调节PH至7.4，用去离子水定容至1L，经高压蒸汽灭菌即得。