[发明专利]猪圆环病毒2b亚型自身表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的构建方法和应用

说明书

本发明提供一种猪圆环病毒2b亚型自身表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的构建方法和应用，将Cap蛋白上重要中和表位²²⁶LKDPPLNP²³³以重复串联的方式连接于CapE2基因C段，并构建于pFastBac^TMI载体上，借助昆虫杆状病毒表达系统对重组CapE2蛋白进行表达，得到目的重组蛋白。本发明对PCV2亚单位疫苗的研制具有一定借鉴意义，同时为PCV2诊断方法的研究及相关基础研究提供了前期基础。

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2b亚型自身表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Disease，PCVAD)的主要病原体，包括断奶仔猪多系统综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍综合征(SRDS)等疾病，PCV2与伪狂犬病毒(PRV)、细小病毒(PPV)、肺炎支原体等发生共感染也是造成以上疾病的重要原因。PCV2是一类单链无囊膜环状DNA病毒，主要感染淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞，导致动物机体出现严重的免疫抑制反应，一旦发病，病死率较高，给养猪业带来巨大的经济损失。

PCV2基因组长度在1767-1768bp，包含11个开放阅读框(ORF1-11)，ORF1和ORF2是最主要的开放阅读框。ORF1编码两个复制酶蛋白Rep(Rep’)，ORF2编码PCV2唯一的结构蛋白Cap。Cap蛋白包含了病毒的重要中和表位，如²²⁶LKDPPLNP²³³、¹³⁸YDPYVNY¹⁴⁴等，是PCV2主要的免疫蛋白，且与PCV1的Cap蛋白没有抗原交叉反应，能够在体外自组装成VLP(virus-like-particle)，因此通常作为PCV2疫苗研制的首选蛋白。

目前，针对PCV2的防控手段以疫苗免疫为主，相比现有的灭活疫苗和弱毒疫苗，PCV2亚单位疫苗能够有效的避免灭活疫苗生产中由于灭毒不完全、纯化的抗原中内毒素残存含量较高，造成动物再次感染病毒的风险，但是现有亚单位疫苗并不能有效预防PCV2的感染。因此，进一步提高PCV2亚单位疫苗免疫原性及保护性成为疫苗研发中亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种猪圆环病毒2b亚型自身表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的构建方法和应用，通过昆虫杆状病毒表达系统表达的重复连接两个中和表位的Cap蛋白，能够自组装形成病毒样颗粒，并且具有较好的免疫原性，为PCV2感染的预防提供了新的疫苗候选。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

用于构建基于猪圆环病毒2b亚型病毒样颗粒的引物，所述引物为该病毒蛋白C端连接中和表位的重组CapE2基因的引物，引物序列如下：

cap-F：GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGT；

capE2-R：

AAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTC。

一种如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型病毒样颗粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)目的基因的扩增

利用权利要求1所述的引物cap-F和capE2-R，对原始Cap基因和构建的C端重复串联两个中和表位²²⁶LKDPPLNP²³³的重组CapE2基因进行扩增，得到目的基因扩增产物；

(2)重组表达载体的构建