[发明专利]利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法有效
| 申请号： | 202110517953.5 | 申请日： | 2021-05-12 |
| 公开（公告）号： | CN113234758B | 公开（公告）日： | 2022-11-15 |
| 发明（设计）人： | 毕延震;肖伟;华再东;任红艳;朱喆;张立苹;顾浩 | 申请（专利权）人： | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/877;C12N15/12;C12N5/10;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 苏士莹 |
| 地址： | 430064 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 利用 piggybac 转座酶 系统 构建 工程 动物 方法 | ||
1.一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将PCR扩增的IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；
b、PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，将扩增得到左臂插入初级载体的EcoRI和NsiI位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；
c、将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
d、将PCR扩增的pbase插入pcDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体；
e、将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
f、将胚胎移植至母猪，得到工程猪；
步骤c和步骤d没有时间先后顺序。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a所述PCR扩增的上游引物PB-IGFm-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物PB-IGFm-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT1-LAF1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PBT1-LAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT3-RAF2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物PBT3-RAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d所述PCR扩增的上游引物pbase-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物pbase-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸110s，30个循环。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c所述共转染的方式为电转染。
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