[发明专利]利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法

说明书

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。本发明利用受体基因组天然的“TTAA”四联体序列，以及修复模板上携带的PiggyBac转座酶的识别序列，将基因打靶过程中引入的选择标记基因删除，实现无残留的基因编辑，从而彻底消除生物安全隐患。由此可见，采用本发明所述PiggyBac转座酶系统能实现“无痕”打靶，解决了现有技术无法克服的瓶颈。而且本发明将CRISPR/Cas9和PiggyBac两个技术联合使用能够实现保真度100％的基因突变和无残留基因编辑，是目前生物安全技术水平最高的方法。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。

背景技术

基因打靶技术发展至今已有40余年。回溯其发展历史，基因打靶技术可分为两个阶段。一是传统基因打靶，最初是基于胚胎干细胞的体外培养，通过同源重组修复方式将外源基因靶向受体基因组特点位点，实现内源基因的定点敲除及外源基因的定点表达，其缺点是打靶效率低下，同时也会引入外源标记基因，这对于畜禽育种不利。二是CRISPR/Cas9介导的基因打靶技术，该类技术在精准性和效率方面，产生了质的飞跃。即利用CRISPR/Cas9引发基因组DNA的双链断裂，通过细胞的自身修复机制实现外源基因的定点整合，但该过程中容易产生核苷酸片段的随机插入、缺失或突变等，同样也会引入无法删除的外源标记基因。考虑到无意义的外源基因片段会给生物安全带来隐患，科研家研发了一种删除标记基因的工具，即利用CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用，将loxP瞄定在标记基因两侧。在得到阳性细胞后，Cre重组酶特异识别loxP位点并删除标记基因。该技术一方面可实现高效的基因打靶，另一方面也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而，筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列，严重影响外源基因表达的效率，甚至造成移码突变，给基因打靶相关的研究带来极大难题，同时在生物安全及伦理层面仍然存在一定的局限性。要突破这一瓶颈，研发“无痕”打靶技术成为当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。采用本发明所述PiggyBac转座酶系统能实现“无痕”打靶，解决了现有技术无法克服的瓶颈。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了PiggyBac转座酶系统在构建无痕工程动物中的应用。

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将PCR扩增的标签基因插入第一载体，得初级载体；

(2)PCR扩增动物基因组的左右臂，将PCR扩增得到的左臂和右臂插入初级载体，得到第一重组载体；

(3)将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；

(4)将PCR扩增的目标基因插入第二载体，得第二重组载体；

(5)将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；

(6)将胚胎移植至母猪，得到工程动物；

步骤(3)和步骤(4)没有时间先后顺序。

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，包括以下步骤：

a、将PCR扩增的IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；

b、PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，扩增得到将左臂插入初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；