[发明专利]糖胺聚糖己糖胺测定方法

说明书

本发明涉及糖胺聚糖己糖胺测定方法，包括按预定方法对系列浓度的标准糖胺聚糖溶液进行处理并测定吸光度，建立标准曲线；按预定方法对目标糖胺聚糖样品溶液进行处理并测定吸光度，根据标准曲线、并结合标准糖胺聚糖中的己糖胺含量计算出目标糖胺聚糖样品的己糖胺含量；预定方法为：将糖胺聚糖溶液在酸性条件下加热水解，冷却后加入亚硝酸钠进行反应，之后加入氨基磺酸氨进行中和并使pH呈弱酸性；然后加入显色剂MBTH进行络合，再加入氯化铁中和过量的MBTH并显色；检测650nm处的吸光度。本发明测定方法简单易行、方便快捷、准确率高，可以作为糖胺聚糖己糖胺的快速检测来应用。

技术领域

本发明涉及一种糖胺聚糖己糖胺测定方法，属于生物化学分析技术领域。

背景技术

据发明人所知，糖胺聚糖是一类广泛存在于细胞表面和细胞外基质的生命大分子，所有的哺乳动物都合成糖胺聚糖，其功能为维持细胞完整性，插入细胞膜来调控细胞间的信号传导等。糖胺聚糖信息含量丰富，是在一系列酶的催化下合成，个体差异大，对于糖胺聚糖的结构解析，没有任何模板可参照，也无法推导出结构。

糖胺聚糖是由重复的二糖单元(已糖/已糖羧酸与已糖胺)组成，根据结构、构象、连接方式等差异可以分为四类(如图1所示)：肝素/硫酸乙酰肝素类(heparin/heparansulfate,Hp/HS)、硫酸软骨素/硫酸皮肤素类(chondroitin sulfate/dermatan sulfate,CS/DS)、透明质酸类(hyaluraonic acid,HA)和硫酸角质素类(keratan sulfate,KS)。这些糖胺聚糖均由重复的己糖或者己糖醛酸与己糖胺二糖单元构成。

研究发现，糖胺聚糖是一类体内重要的生物大分子，可通过与其他因子诸如细胞粘附因子、酶等结合调节体内复杂的生物学过程，同时糖胺聚糖在临床上对抗凝血、炎症反应以及肿瘤的转移等病理过程都有辅助作用，因此亟待建立合适的方法对细胞外基质材料的原材料、半成品、成品中的糖胺聚糖进行检测。

己糖胺(hexosamine)是己糖的羟基为氨基代换所形成的化合物之总称。已糖胺作为糖胺聚糖的重要组成成分，对其成分进行检测来反推糖胺聚糖的含量，显得尤为重要。高效液相色谱是一个常用的糖胺聚糖的检测方法，可以用来检测量化大部分种类的糖胺聚糖，例如，P.W.LARKING等^[1]发明了一种气相色谱法来检测尿液和血浆中糖胺聚糖己糖胺的方法。然而这种检测方法比较耗时，且需要荧光检测器和Pico-tag水解站的高效液相色谱仪，大多数的实验室都难以具备上述仪器。

经检索发现，申请号CN201010144058.5、申请公布号CN101839850A的发明专利申请公开了一种溶菌酶活力的测定方法，其中包括：先以溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖产生N-乙酰氨基葡萄糖，再以MBTH法测定N-乙酰氨基葡萄糖的含量。同时，张永勤等^[2]的研究表明，MBTH法虽然在检测乙酰氨基葡萄糖时的检测限(1.188μmol/L)和定量限(3.960μmol/L)均足够低，但是在检测氨基葡萄糖时，检测限仅为4.286μmol/L，且定量限仅为14.286μmol/L。综合以上情况来看，现有的MBTH法顶多适于检测糖胺聚糖经酶解产生的N-乙酰氨基葡萄糖，这一方面无法适用于肝素/硫酸乙酰肝素类的己糖胺测定，另一方面需要利用糖胺聚糖水解酶才能顺利实施测定，势必会增加成本。

注：[1]P.W.LARKING.Quantitative gas chromatographic measurement ofglycosaminoglycan hexosamines in urine and plasma.J Chromatography,420(1987)231-239.

[2]张永勤，等.还原糖测定方法的比较研究[J].食品工业科技,2010,31(06):321-326.

发明内容

本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种糖胺聚糖己糖胺测定方法，通过对糖胺聚糖水解产生的己糖胺进行处理，即可实现准确测定。