[发明专利]一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法

权利要求书

1.一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。

2.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述过滤包括如下步骤，将所述水样在采集后避光保存并在24h内使用混合纤维素脂膜进行真空过滤处理，抽滤完后将所述混合纤维素脂膜放置2mL离心管中并立即保存于-20℃或进行后续步骤。

3.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述混合纤维素脂膜的孔径为0.45μm。

4.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的5’端均添加有核苷酸序列如SEQID.NO3所示的标签。

5.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；55个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s，延伸72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。

6.根据权利要求5所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA0.25μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，eDNA 2～5μL，余量为ddH₂O。

7.根据权利要求6所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/μL 0.09～0.11U、dNTP 490～510μM、Tris-HCl 20～50mM、KCl 20～100mM、MgCl₂ 3～4mM。

8.根据权利要求7所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/uL 0.1U、dNTP 500μM、Tris-HCl 20mM、KCl 100mM、MgCl₂ 3mM。

9.根据权利要求7所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/uL 0.1U、dNTP 500μM、Tris-HCl 50mM、KCl 20mM、MgCl₂4mM。

10.根据权利要求1所述的利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述提取eDNA所用试剂盒为Qiagen DNeasy Blood and Tissue DNA extraction kit的试剂盒，提取eDNA时每2mL EP管中所用的ATL buffer的用量为720μL，所述Proteinase-K的用量为80μL，其中裂解时间为3h，裂解温度为56℃，洗脱时所用的缓冲液为EB buffer。