[发明专利]一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法

说明书

本发明提出了一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，涉及分子生态学技术领域。该利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行高通量测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。本发明的优点在于，该方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性，并且检测结果精准，可检出的种类多。

技术领域

本发明涉及分子生态学技术领域，具体而言，涉及一种利用环境DNA 技术检测鱼类物种多样性。

背景技术

环境DNA(environmentalDNA，eDNA)于20世纪70年代末被首次 提出，是指从有机体脱落释放出来的游离的DNA分子，存在于土壤、沉积 物、空气和水体等环境中。环境DNA提取技术最早被用于分离和纯化沉积 物中微生物的DNA。近年来，环境DNA技术被应用于生物多样性分析、 生物量估测、珍稀物种发现、生物入侵物种的监控以及群落系统发育重建 等生态学研究领域。通过环境DNA技术，可以在提取DNA片段后利用测 序技术进行定性或定量分析环境中的物种种类和物种生物量。

传统的湖泊生物多样性的研究主要有捕捞法和声学探测法。捕捞法是 通过对水体中的鱼类进行捕捞，捕捞存在作业强度高、成本高、准确性低 以及破坏鱼类资源等问题。声学探测法受限于水域理化指标和天气状况， 而且无法实现大面积调查。为了解决传统方法中存在的技术问题，人们开 始考虑使用环境DNA技术监测水体中鱼类的物种多样性。如“用于鱼类群 落结构研究的环境DNA鉴定方法”(CN201510005835.0)，其包括如下步 骤，步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；步骤(2)：将所述 的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；步骤(3)：将所述的总环境 DNA采用核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的16S rDNA序列作为 通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤(4)：将所述的PCR产物进 行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；步骤(5)：将所述的带有DNA的凝胶 进行切胶克隆测序后通过GENBANK进行blast比对，以确定所述的DNA 是否为鱼类序列；步骤(6)：确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序 技术对所述的PCR产物的组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA 的鱼类群落组成及分布，可以在一个PCR样品中获得几千乃至上万条16S rDNA条带，有利于统计和增加研究的精确性，同时降低了固定样品数下样 品采集的成本。然而这种鉴定方法还存在一些缺陷，比如检测精度不够， 结果准确率有待提高。针对这一技术问题，“一种基于环境DNA技术检测 鱼类物种多样性的方法”(CN201910216942.6)，其包括如下步骤：(1) 取待测水域的表层水样；(2)将所取的水样进行处理，提取eDNA；(3) 以提取的eDNA为模板，CytbF(序列如SEQIDNO:1)和CytbR(序列如SEQIDNO:2)、16SF(序列如SEQIDNO:3)和16SR(序列如SEQIDNO:4) 为引物，PCR扩增，得到PCR产物；(4)回收、纯化目的片段，构建目 的片段文库，进行高通量测序后的原始数据优化后获得高质量序列；(5) OTU聚类：应用软件Vsearch2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进 行聚类，产生可操作性分类单元(operationaltaxonomicunits，OTUs)；(6) 建立鱼类本地比对数据库；(7)OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的 数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利 可以在保证检测精度的基础上，检测到21～38种鱼类。然而，该方法的检 测量还存在一定的问题，无法在相同检测时间内监测到更多的物种。

因此，需要研发一种检测精度高，检测量大的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性 的方法，此方法通过采用如SEQID.NO 1和SEQID.NO 2所示的引物组检测 水体鱼类多样性，检出率高，检出量大。