[发明专利]基于融合标签促溶壳聚糖酶表达的方法、重组融合壳聚糖酶

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基于融合标签促溶壳聚糖酶表达的方法、重组融合壳聚糖酶，在来源于芽孢杆菌的壳聚糖酶MH636588.1基因上融合融合标签sfGFP，mCherry，cl7，并在标签与壳聚糖酶基因之间加入TEV酶切位点序列SEQ ID No.4；同时在目标基因的C端融合12*HIS，通过镍柱实现对目的蛋白的纯化；通过TEV酶切，将融合标签切下来，获得纯酶。本发明涉及一种利用融合标签，促进壳聚糖酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法，通过标签的促溶，获得可以催化壳聚糖制备壳寡糖的工程酶，为壳寡糖的工业化生产提供一种新酶，也为壳寡糖的异源表达提供一种新途径。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于融合标签促溶壳聚糖酶表 达的方法、重组融合壳聚糖酶。

背景技术

目前，甲壳素是地球上仅次于纤维素第二大可再生资源，也是除蛋白质外数 量最大的天然含氮有机化合物，是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-(1,4)-糖苷键聚合而 成的直链多聚体。甲壳素部分或完全脱去乙酰基生成的衍生物为壳聚糖。由于壳 聚糖主要来源于生物体，具有无毒、无害、安全可靠、易生物降解、不造成二次 污染等优点，因此在许多领域如食品、医药、生物材料、污水处理等具有重要的 应用。但同时因为壳聚糖的水溶性差，限制了其在更多领域的进一步应用。而壳 聚糖的降解产物壳寡糖，具有很好的水溶性，已在农业、医药、功能性食品等多 领域表现出更好的应用效果。

壳聚糖降解制备壳寡糖有化学法与生物法。化学法是通过强酸在高温条件下 断裂多糖间的糖苷键，易造成环境的污染及能源的高耗；产物组分不容易控制， 产物得率低。所以，国内外主要选择生物酶法水解壳聚糖。由于壳聚糖的结构类 似纤维素，目前发现有30多种非专一性的酶能水解壳聚糖，如纤维素酶、蛋白 酶、脂肪酶等，但这些酶产生的壳寡糖产物成分比较复杂，反应过程不容易控制； 另酶的水解活性较低，相对产品成本高。而利用专一性的壳聚糖酶，特异性降解 壳聚糖，可得到高产量的壳寡糖。由于其反应特异性强，壳聚糖的转化率、产物 分子量分布、酶解产物稳定性及副产物的生产，都要较化学法与非专一性酶法有 巨大的优势。另可通过控制反应时间，水解制备不同系列分子量的寡糖混合物， 因此在生产上有很好的应用前景，其作为制备壳寡糖的首选。壳聚糖酶主要来源 于细菌与真菌。壳聚糖酶在天然宿主中不能持续表达，需要一定的诱导底物；并 且宿主分泌量低，限制了其在工业上的大规模应用。国内外研究者一方面继续从 自然界中筛选产壳聚糖酶的菌株，优化其产酶条件；另一方面利用分子生物学手 段构建基因工程菌株，以获得高产菌，实现壳聚糖酶的高效表达。

壳寡糖产业中，生产成本是限制规模化生产的重要因素。构建高效的工程菌， 提高酶活表达，优化后处理技术和制剂技术，是降低其生产成本，助推规模化、 产业化的关键。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)壳聚糖降解制备壳寡糖的方法中，化学法是通过强酸在高温条件下断 裂多糖间的糖苷键，易造成环境的污染及能源的高耗；产物组分不容易控制，产 物得率低。

(2)由于壳聚糖的结构类似纤维素，目前发现有30多种非专一性的酶能水 解壳聚糖，但这些酶产生的壳寡糖产物成分比较复杂，反应过程不容易控制；另 酶的水解活性较低，相对产品成本高。

(3)壳聚糖酶在天然宿主中不能持续表达，需要一定的诱导底物；并且宿 主分泌量低，限制了其在工业上的大规模应用。

解决以上问题及缺陷的难度为：

筛选到合适的表达载体和宿主用来表达壳聚糖酶。

得到合适的融合标签，促进壳聚糖酶的表达和可溶性。

解决以上问题及缺陷的意义为：

建立起壳聚糖酶的大规模表达平台和技术，为工业化应用奠定基础；

建立起从壳聚糖制备壳寡糖的工艺路线，为低成本制备壳寡糖奠定基础。

发明内容