[发明专利]一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法

权利要求书

1.一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其步骤如下：

S1、将南极磷虾肉加水匀浆，制备底物蛋白浓度为20～40mg/mL的南极磷虾肉匀浆液；再沸水浴煮沸5～15min进行变性预处理，得到南极磷虾肉酶解底物溶液；待溶液冷却至40～60℃后调节pH至8.5，并按5000U/g底物蛋白的比例加入碱性蛋白酶，在pH 8.5、40～60℃条件下进行酶解；

S2、在步骤S1南极磷虾肉酶解底物溶液酶解过程中，通过pH-stat滴定法测定不同酶解时间的南极磷虾酶解液的水解度；

在测定水解度的同时，将1mg/mL南极磷虾酶解液与2mM FeSO₄水溶液混合，振荡反应10～20min，再加入5mM菲洛嗪水溶液，振荡反应10～20min，采用酶标仪在562nm处测定吸光度，得到不同酶解时间的南极磷虾酶解液的铁结合活性，将酶解液呈现最高铁结合活性时对应的水解度范围确定为最适水解度；

在测定水解度的同时，对南极磷虾酶解液进行近红外光谱实时在线检测，得到不同酶解时间的南极磷虾酶解液的近红外光谱；

S3、将步骤S2得到的近红外光谱在不同波长处的吸光度数据利用OPUS软件和一阶导数法进行光谱预处理，在9400～7496cm^-1、6104～5448cm^-1光谱区采用偏最小二乘法构建南极磷虾近红外光谱中不同波长处吸光度数据与酶解反应水解度的关联，以交互验证相关系数(R²)、交互验证均方根误差(RMSECV)为评价指标，建立南极磷虾酶解反应在线监测模型；

S4、将南极磷虾肉加水匀浆，制备蛋白浓度为20～40mg/mL的南极磷虾肉匀浆液；再沸水浴煮沸5～10min进行变性预处理，得到南极磷虾肉酶解底物溶液；待南极磷虾肉酶解底物溶液温度冷却至40～60℃后调节pH至8.5，并按5000U/g底物蛋白的比例加入碱性蛋白酶，在pH 8.5、40～60℃条件下开始进行酶解；在酶解过程中，对酶解液进行近红外光谱实时在线检测，利用OPUS软件和一阶导数法进行光谱预处理，通过步骤S3构建的南极磷虾酶解反应在线监测模型将实时的近红外光谱不同波长处吸光度数据转化为实时的酶解反应水解度，当水解度达到步骤S2中所述的最适水解度时结束反应，加热使酶失活，调节pH至7.0，离心后收集上清液，真空冷冻干燥得到具有铁结合活性的南极磷虾肽。

2.如权利要求1所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：步骤S1中，是用0.5～2.0mol/L的NaOH调节pH至8.5。

3.如权利要求1所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：步骤S2中，近红外光谱实时在线检测是将连接在Matrix-F在线型傅里叶变换近红外光谱仪上的透反射探头浸入到南极磷虾酶解液中，以空气为背景参比，采用三维立体角镜干涉技术，通过铟镓砷检测器实时在线采集南极磷虾酶解液的近红外光谱数据。

4.如权利要求3所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：透反射探头的光程为1mm；扫描光谱范围为11500～4000cm^-1，扫描次数为64次，扫描速度为8次/秒，分辨率为8cm^-1。

5.如权利要求1所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：步骤S3中，南极磷虾酶解反应在线监测模型的交互验证相关系数R²为0.982，交互验证均方根误差RMSECV为0.721。

6.如权利要求1所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：步骤S4中，当水解度达到19～20％时酶解液呈现最高的铁结合活性；然后在95～100℃下加热8～15min使酶失活结束酶解反应，调节pH至7.0，离心后收集上清液，真空冷冻干燥得到南极磷虾铁结合活性肽。

7.如权利要求1所述的一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，其特征在于：采用所构建的南极磷虾酶解反应在线监测模型对南极磷虾酶解反应过程中的水解度进行预测，预测值与实测值的偏差小于1％。