[发明专利]一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法

说明书

一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法，属于生物活性肽酶解实时在线监控技术领域。本发明首先是测定南极磷虾酶解液的水解度，在测定水解度的同时，对酶解液进行近红外光谱实时在线检测，得到不同酶解时间的南极磷虾酶解液的近红外光谱；再利用OPUS软件和一阶导数法进行光谱预处理，在9400～7496cmsupgt;‑1/supgt;、6104～5448cmsupgt;‑1/supgt;光谱区采用偏最小二乘法构建南极磷虾酶解反应在线监测模型。本发明构建的基于傅里叶变换近红外光谱技术的南极磷虾酶解反应在线监测模型，交互验证相关系数(Rsupgt;2/supgt;)为0.982，交互验证均方根误差(RMSECV)为0.721；利用建立的酶解液模型对南极磷虾酶解液的水解度进行预测，预测值和实测值的偏差小于1％，吻合度较高。

技术领域

本发明属于生物活性肽酶解实时在线监控技术领域，具体涉及一种南极磷虾酶解反应的实时在线监控方法。本发明所述方法可在生物活性肽酶解制备生产线上动态监测水解过程，实现智能化可控酶解，从而最大程度获取目标活性肽。

背景技术

南极磷虾(Euphausia superba)是地球上最大的单种生物资源之一。据联合国粮农组织(FAO)统计，南极磷虾的总生物量约1.25～7.25亿吨，年可捕捞量约0.13～1亿吨，相当于全球海洋捕捞总产量。因其富含优质蛋白，被认为是地球上最大、也是最后一个潜在动物性蛋白资源库。南极磷虾肉中蛋白质量含量高达72％，富含酸性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)，而酸性氨基酸具有丰富的铁结合位点。因此，南极磷虾肉是一种非常有潜力的生物酶解法制备铁结合活性肽的原料。

生物酶解法制备铁结合活性肽过程中，酶解的程度对其铁结合活性具有重要的影响，通常用水解度(DH)来表示。酶解反应可释放具有铁结合位点的活性肽，然而过度水解可能会破坏已经暴露的铁结合位点，从而使肽的铁结合活性降低。因此，确定水解度以实现蛋白酶的可控酶解对于酶解产物的铁结合活性具有重要作用。目前，常用的水解度测定方法有pH-stat滴定法、甲醛滴定法、对苯二醛法和三硝基苯磺酸法等。pH-stat滴定法可实时监控水解度，根据酶解过程中氢氧化钠溶液的消耗量来计算水解度；然而由于在酶解液中加入了氢氧化钠，可能会对最终多肽产品的品质产生影响。甲醛滴定法、对苯二醛法和三硝基苯磺酸法都需要离线测定水解度，不仅耗时长、工作量大，而且数据具有滞后性。因此，需要建立一种酶解反应过程的实时在线监控方法以实现铁结合活性肽的可控制备。

近年来，近红外光谱技术已应用于酶解反应过程的在线监测。如：基于原位实时光谱在线监测蛋白质酶解过程的装置和方法(公开号：CN105628644A)，一种基于胃肠消化的大分子多肽制备原位实时监测方法(公开号：CN108107018A)，酪蛋白酶解反应过程的近红外光谱在线监测技术研究(中国食品学报,2019,19(12):220-227)。上述研究采用的均是光栅型近红外光谱技术，通过光栅的转动分光，使单色光按照波长的高低依次通过样品，进入检测器检测。为了获得高分辨光谱需要限制光束(狭缝)，使得光通量降低，检测灵敏度下降；测量精度低，分辨率低，波长准确度差；采集的近红外光谱容易受到杂散光的干扰；扫描速度慢，通常为1次/分钟，扩展性能差。因此，光栅型近红外技术可用于实验室研究，不适合应用于生物活性肽酶解制备生产线上的实时在线检测。

偏最小二乘法(PLS)是一种广泛用于近红外分析的算法，已被列入《ASTM-E-1655红外多元定量分析标准》，作为近红外分析的一种标准算法，该方法的优点是能够充分提取近红外光谱的有效信息，考虑了光谱矩阵和样品成分矩阵之间的内在联系性，适用于复杂体系的分析。

判断模型优劣程度通常有三个评价指标：第一个为模型决定系数R²，它的大小决定了预测值与实测值之间相关的密切程度；第二个为预测均方根误差RMSECV，它反映了交叉检验时预测值与实测值之间的偏离程度。一个好的模型，应该具有较高的R²和较低的RMSECV值。故本发明在建模过程中以R²和RMSECV为指标，选择合适的光谱预处理方式、光谱区间、维数，建立预测模型。