[发明专利]一株球孢白僵菌B2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用

说明书

本发明提供了一株球孢白僵菌B2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用，本发明的球孢白僵菌B2660的保藏日期为2021年4月6日，保藏编号为CCTCCNO：M2021337，其分类命名为球孢白僵菌菌株B2660(Beauveria bassiana B2660)；该球孢白僵菌B2660能将苯甲酸直接转化为对羟基苯甲酸。在催化24h时球孢白僵菌B2660可将10g/L苯甲酸催化合成8.75g/L的对羟基苯甲酸，转化率达87.5％；同时可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一株球孢白僵菌B2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用。

背景技术

对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate,4-HBA)是一种用途广泛的有机合成原料，其酯类衍生物，如甲酯(尼泊金甲)、乙酯(尼泊金乙)、丙酯、丁酯、异丙酯、异丁酯，可做食品添加剂，添加在酱油、醋、清凉饮料(汽水除外)、果品调味剂、水果及蔬菜、腌制品等中。此外，4-HBA酯类衍生物还主要用于液晶聚合物和新型耐高温聚合物用于材料领域。同时，4-HBA也用作染料、农药的中间体和尼龙的增塑剂。现行的4-HBA化学生产是从石油成分合成而得，整个合成工艺必须在高温高压下进行，消耗大量的能源，而且生产过程中有环境污染物苯酚的生成。同时较难进行高纯度的产物的分离纯化工作，或其分离纯化的成本较高。利用可再生资源生物合成4-HBA及其衍生物将是解决环境污染和资源枯竭的重要途径之一。

采用生物法合成4-HBA，对生产的设备以及成本都大大降低，还有反应条件更加温和、对环境更加友好、更加符合绿色工业的要求等优点。目前生物法合成4-HBA主要有如下几种方式：(1)改造植物的莽草酸途径，分别从分支酸、苯丙素和苯丙氨酸出发合成4-HBA。但在植物中的4-HBA通常被糖基化或者酯化，分离纯化困难。(2)改造酵母的莽草酸途径，如耿娜在酿酒酵母中引入大肠杆菌的ubiC基因，以分支酸为底物合成4-HBA，4-HBA产量达到11.34mg/L；进一步过表达Aro4基因，4-HBA使其产量达到35.02mg/L(生物合成对羟基苯甲酸的酿酒酵母基因工程菌的构建[D].北京化工大学2019)。(3)构建大肠杆菌或恶臭假单胞菌工程菌，发酵产生4-HBA。如Frost课题组构建了一株重组大肠杆菌工程菌，能利用葡萄糖发酵4-HBA，发酵产量达到了12.0g/L(Biotechnology Bioeng,2001,76(4):376-390.)。Verhoef等构建恶臭假单胞菌工程菌株，将4-HBA羟化酶基因pobA敲除后，避免了4-HBA合成后进一步降解，同时构建一个载有苯丙氨酸解氨酶基因的质粒，最终该菌株能将酪氨酸通过苯丙氨酸解氨酶转化为对羟基肉桂酸，然后利用对羟基肉桂酸降解途径合成4-HBA(Applied MicrobiologyBiotechnology,2010,87(2):679-690.Biotechnology,2007,132(1):49-56.)。

除了如上通过工程菌构建的方法外，直接筛选相关菌株进行4-HBA的生物合成，方法更为简单。如朱莉等利用微泡菌具有4-HBA合成能力，产量可达19μmol/L(微泡菌生物合成对羟基苯甲酸及其酯类物质的研究[D].江苏师范大学,2016)。可以看出，目前生物法合成4-HBA，主要依赖发酵的方法，从葡萄糖出发对莽草酸途径及相关途径进行改造最终合成4-HBA，途径改造时涉及酶和相关基因较多，且4-HBA产量往往不高。

综上可知，上述这些现有的方法，步骤较繁琐，4-HBA产量较低；因此，如何开发一种新的菌种应用于生物转化，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一株球孢白僵菌B2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用，筛选出的球孢白僵菌B2660能将苯甲酸直接转化为对羟基苯甲酸，通过一步生物转化就合成了4-HBA，可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。