[发明专利]一种基于H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶可视化检测GPC3的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的基于血红素-还原氧化石墨烯-铂@钯纳米酶-适配体H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt检测探针用于可视化检测GPC3的方法，其特征在于，采用如下步骤：

(1)血红素-还原氧化石墨烯H-rGO的制备

将还原氧化石墨烯rGO与血红素Hemin混合，水浴，离心、洗涤，得到血红素-还原氧化石墨烯H-rGO纳米复合材料；

(2)血红素-还原氧化石墨烯-铂@钯纳米酶H-rGO-Pt@Pd NPs的制备

①往H-rGO溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA溶液和NaCl溶液，搅拌反应；离心、洗涤，得到被PDDA修饰的H-rGO复合纳米材料；

②将Na₂PtCl₆和Na₂PdCl₄溶液加入被PDDA修饰的H-rGO复合纳米材料，搅拌；加入乙二醇溶液和NaOH溶液调节pH值，恒温水浴反应；离心、洗涤，即得H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶；

(3)H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt检测探针的制备

取GPC3适配体GPC3-Apt和H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶溶液超声混合，将混合液室温孵育，离心洗涤，得H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt检测探针；

(4)GPC3可视化检测体系的构建

将捕获探针GPC3抗体GPC3-Ab滴加到试管内，加入牛血清蛋白BSA溶液进行封闭，加入GPC3溶液；加入H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt检测探针；再加入显色底物体系TMB-H₂O₂，形成GPC3可视化检测体系；

(5)GPC3的工作曲线绘制

将待测的不同浓度GPC3溶液滴加到步骤(4)得到的最佳GPC3可视化检测体系中，采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度，根据吸光度和GPC3浓度的关系，绘制工作曲线，计算检测限；

(6)实际血清样本中GPC3的检测

将已知浓度的GPC3溶液和实际人血清样本混合，添加到根据步骤(4)得到的最佳GPC3可视化检测体系中，采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度；利用步骤(5)所得到的GPC3工作曲线，计算得出实际血清样本的GPC3浓度。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中rGO与Hemin混合体积比为1:1-4。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)①中PDDA溶液为2.0mL 0.2％，NaCl溶液为5.0mL 0.2mol/L。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)②中pH值为11-13。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)②中Na₂PtCl₆和Na₂PdCl₄溶液均为2.0mL 20mmol/L。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，GPC3-Apt浓度为5.0μmol/L，H-rGO-Pt@Pd NPs浓度为1.0mg/mL，混合体积比为1:1-5。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中捕获探针GPC3-Ab为100μL10μmol/L；所述的GPC3溶液为100μL；所述的BSA溶液为100μL 1％；所述的H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt为100μL；所述的100μL TMB-H₂O₂中TMB为12.84mmol/L，H₂O₂为28.44mmol/L。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中H-rGO-Pt@Pd NPs-Apt浓度为1.0-7.0μg/mL，孵育时间为0.3-3h、孵育温度为15-45℃。