[发明专利]一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法

权利要求书

1.一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于，方法步骤如下：

(1)绵羊毛干的预处理：

(2)绵羊毛干的裂解消化：向每个装有毛干样品的EP管中加入inhibitEX Buffer试剂，涡旋至混合均匀，加热，涡旋，接着向每个EP管中加入蛋白酶K溶液、二硫苏糖醇溶液和Buffer AL试剂，涡旋混匀，再孵育至消化完全，获得毛干消化液；

(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提，获得DNA溶液提取结果。

2.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述(1)具体为：

称取绵羊毛干样品，放入培养皿中，用去离子水冲洗揉搓至无明显杂质脏污后，换干净去离子水浸泡，后将毛干从水中取出，用滤纸吸干水分，放入新的培养皿中，加无水乙醇冲洗揉搓1遍，换新无水乙醇浸泡，后将毛干从无水乙醇中取出，用滤纸吸干乙醇，放入新的培养皿中；晾干后用剪刀将毛干剪成小段，分装至EP管中。

3.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：在所述(2)的孵育过程中，定时翻动EP管，并视情况补加蛋白酶K溶液和二硫苏糖醇溶液。

4.根据权利要求1或3所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml，二硫苏糖醇溶液浓度为2mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述(3)具体为：

(3.1)将毛干消化液离心析出沉淀，将上清液转移至EP管中，加无水乙醇，涡旋15s后获得混合液；

(3.2)接着取600μl混合液到QIAamp收集柱中，收集柱下装有收集管，盖上盖子，离心，将QIAamp收集柱从原有收集管取出，舍弃原有收集管，将QIAamp收集柱放置到新的一个收集管；

(3.3)不断重复步骤(3.2)对混合液分批依次处理，直到混合液的所有均被QIAamp收集柱离心过滤，最终的收集管作为第一收集管；

(3.4)打开第一收集管上的QIAamp收集柱的盖子并加Buffer AW1试剂，离心，将QIAamp收集柱从第一收集管中取出转移到一个新的的第二收集管中；

(3.5)打开QIAamp收集柱的盖子并加Buffer AW2试剂，离心，将QIAamp收集柱从第二收集管中取出转移到一个新的2ml的第三收集管中；

(3.6)再将QIAamp收集柱离心，将QIAamp收集柱从第三收集管中取出放到一个新的1.5ml EP管中；

(3.7)取在56℃下加热5min的Buffer ATE试剂添加到EP管上，常温孵育，然后离心，从而将DNA洗脱至EP管中，EP管中的溶液为DNA溶液；

重复取EP管中的DNA溶液加至QIAamp收集柱中，常温孵育，然后离心，从而再次将DNA洗脱至新EP管中，取出新EP管上的QIAamp收集柱，新EP管中的溶液作为最终的DNA溶液。

6.根据权利要求5所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3.7)中，Buffer ATE溶液是在56℃下加热5min后加入到EP管。

7.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中的inhibitEX Buffer试剂、Buffer AL试剂、Buffer AW1试剂、Buffer AW2试剂、Buffer ATE试剂均为QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒中的试剂。