[发明专利]一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法。用去离子水及无水乙醇对绵羊毛干进行洗涤与浸泡处理，待晾干后用剪刀剪碎，得到毛干碎屑样本，利用inhibitEX Buffer、蛋白酶K溶液、二硫苏糖醇溶液及Buffer AL对样品进行孵育消化，随后离心取上清液加无水乙醇溶解杂质，最后将混合液移入QIAamp收集柱中，用Buffer AW1和Buffer AW2进行洗涤，最终用Buffer ATE将DNA洗脱得到绵羊毛干线粒体DNA。本发明实现了对绵羊毛干中线粒体DNA的充分提取，浓度高杂质少，提高毛干线粒体DNA的提取效率及纯度，有利于后续鉴定及各种分子生物学实验研究等，适用性广，简单且易于操作。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域的一种线粒体DNA提取方法，具体涉及一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法。

背景技术

动物毛发由毛干和毛根两部分组成，主要成分为角蛋白，这种结构使其具有不易腐烂的特点，也因此毛发成为了考古学和法医学的常用对象之一，其中所携带的遗传物质为考古发现和法医鉴定提供了许多信息。比如，利用绵羊皮毛作为纺织纤维在我国有着悠久的历史，在诸多考古遗址中都有毛纤维纺织品文物的发现，提取其中的DNA来科学有效地鉴定纺织品文物中绵羊皮毛的种类，对追溯纺织品起源和研究人类文明具有十分重要的意义。

毛发中的DNA主要集中在毛根的毛囊细胞中，毛干部分仅含有少量线粒体DNA，因而一般利用毛发进行遗传物质提取时常选用毛根部分。虽然在从绵羊体上采集的或脱落的毛发中绝大多数都带有完整的毛囊，但在考古学和法医学鉴定中，常常会发生毛囊己经丢失或者毛根部分己经被破坏的情况，因此则需特定地针对毛干样本进行线粒体DNA的提取。但因毛干几乎所有成分都是角蛋白，从中提取遗传物质相对比较困难，但作为绵羊组织，毛干具有细胞结构，如果提取方法得当仍可以获得一定量的DNA。

现阶段市面上仍缺少专门针对绵羊毛干线粒体DNA提取和纯化的试剂盒，目前常见的毛干DNA提取方法有蛋白酶K法裂解结合酚-氯仿抽提、煮沸和冷却使细胞破裂蛋白质变性而获得DNA、纳米磁珠法等，以上方法操作复杂，样本需求量大，提取效率低，纯度低，还会存在色素干扰等问题，导致分子生物学相关研究受到限制，影响下游工作。本发明针对以上问题，结合QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，进一步针对绵羊毛干的特点进行调整和改良，能利用少量样本得到量足且纯度较高的线粒体DNA，以支持进一步的分子生物学相关研究，并为特殊样本的线粒体DNA提取提供技术参考。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，分别从样本的前处理、消化体系和抽提方法进行了改进，旨在提高毛干线粒体DNA的回收效率和纯度、减少色素污染物对下游实验的干扰等。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)绵羊毛干的预处理：对绵羊毛干进行预处理，得到后续绵羊毛干。

(2)绵羊毛干的裂解消化：向每个装有毛干样品的EP管中加入800μl的inhibitEXBuffer试剂，涡旋1min至混合均匀，95℃加热5min，涡旋15s，接着向每个EP管中加入50μl的蛋白酶K溶液、50μl的二硫苏糖醇溶液和500μl的Buffer AL试剂，涡旋混匀，再56℃孵育至消化完全(24h以上)，获得毛干消化液；

(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提，获得DNA溶液提取结果。

所述(1)具体为：