[发明专利]邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体，其特征在于，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以序列SEQ ID NO.1所示的野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸后得到。

2.权利要求1所述的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，其编码的氨基酸列的序列如SEQ ID NO.5 所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。

4.一种重组菌，其特征在于，通过将权利要求3所述的重组载体转化至宿主微生物中得到。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

6.权利要求4所述的重组菌在制备邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体中的应用。

7.权利要求4所述的重组菌在合成4位取代顺,顺-粘康酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将重组菌种子液接种到培养基中，培养至OD600_nm为0.6-0.8时，加入IPTG，诱导表达后，离心收集菌泥；

（2）酶催化：将步骤（1）得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的粗酶液；向Tris-HCl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺，顺-粘康酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述的Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的终浓度为50-100 mM；4位取代儿茶酚的终浓度为10-90 mM；粗酶液的终用量为0.1-1 U/mL。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述的酶催化反应为在pH6.0-10.0，20-45 ℃反应1-9 h。