[发明专利]邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种邻苯二酚1，2‑双加氧酶突变体及其应用，通过定向突变得到了2个突变酶CatA^V90A和CatA^I206V，在以4‑乙基儿茶酚为底物时，突变体酶CatA^V90A和CatA^I206V与底物的亲和性分别是野生酶的1.62倍和2.03倍，催化效率分别是野生型的1.44倍和2.05倍，以4‑丙基儿茶酚为底物时，突变体酶CatA^V90A和CatA^I206V与底物的亲和性分别是野生酶的1.59倍和2.42倍，催化效率分别是野生型的1.31倍和2.11倍，利用突变酶CatA^I206V催化合成4‑乙基粘康酸产量提高了13.5%，催化合成4‑丙基粘康酸产量提高了24.4%，解决了在合成4位取代粘康酸的过程中酶催化效率低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成4位取代粘康酸创造了良好的条件，反应条件温和，操作简便，具有工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域及酶工程领域，具体涉及邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用。

背景技术

粘康酸，又称己二烯二酸，是一种不饱和二元羧酸。在有机合成工业中，粘康酸可以作为树脂、医药、食品和农药的基础原料。因为粘康酸有立体定向构型、活性二元羧酸基团和共轭双键，所以粘康酸可以发生很多反应，被认为是一种很有价值的中间体，可用于生产各种化学品。在日常生活中，顺，顺-粘康酸常用于生产尼龙原材料己二酸。但是由于高分子主链具备一定的规整性，尼龙大多数呈现白色半透明外观，透明性不好限制了其在某些方面的使用，通过引入含侧基或环结构的单体，破坏分子链规整性，可得到透明尼龙。因此，开发能够高效催化合成含侧基的顺，顺-粘康酸的邻苯二酚1,2-双加氧酶(CatA)具有重要的意义，其中底物含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)可从廉价、可再生的生物质资源中获得，从而使得工艺流程具有满足绿色工业的发展需求的潜能。

定点突变作为分子改造的一种有效方式，被广泛应用于改善酶性质以及提高工业酶制剂的催化效率等方面。在前期研究中，已获得的野生型CatA(专利申请公布号：CN111254151A)与其他来源的重组邻苯二酚1,2-双加氧酶相比，在4位取代顺，顺-粘康酸的制备中具有一定优势。为了进一步提高CatA对底物含侧基的儿茶酚的催化活力，本发明通过定点突变对野生型CatA中位于底物口袋周围的氨基酸残基进行分子改造，得到催化效率有所提高的突变体CatA^V90A和CatA^I206V，提高了CatA在制备4位取代顺，顺-粘康酸上的应用潜力。

发明内容

发明目的：针对目前酶法合成4位取代粘康酸的工艺中存在的酶活性低、底物口袋小、产物得率低等问题，本发明提供了一种催化活性较高、底物口袋较大的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体。

本发明还要解决的技术问题在于提供表达所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的基因及其重组载体和重组表达转化体。

本发明同时还要解决的问题在于提供一种所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的制备方法和所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体在制备4位取代粘康酸中的应用。

为实现上述目的，本发明提出了一种邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸(CatA^V90A)或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸(CatA^I206V)后得到。在野生型CatA氨基酸序列的基础上对第90位缬氨酸残基和第206位异亮氨酸残基进行替换后，仍具有邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性，在此基础上获得了底物口袋扩大的突变体，其中，野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其详细信息披露于专利CN111254151A中。