[发明专利]一种H5N6双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种H5N6双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×BIOG^HSC Super MultiProbe Mix，BIOG^HSC Super Enzyme Mix，H5-F、H5-R、N6-F、N6-R引物，H5-P、N6-P探针，RT-PCR Enhancer，Rnase-free ddH₂O，50×ROX Refer ence Dye，Taq酶保护液，2×BIOG^HSC Super Probe Master mix，阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有H5和N6基因片段的线性质粒，所述阴性对照为PBS，所述的H5-F序列为：GGGACATCAACATTAAACCAGAGA，H5-R序列为：TGCCCGTTTACTTGGGATCT，H5-P序列为：TGGTGCCAAAAATA，N6-F序列为：TGCGAATGGAACCATACATGA，N6-R序列为：TGACCCATTTCCCAACTTATAAGAG，N6-P序列为AGGAGCCCATTTCG。

2.一种H5N6双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，使用方法包括以下步骤：

①提取样品RNA；

②配制荧光定量PCR反应体系，体系如下：

2×BIOG^HSC Super MultiProbe Mix 10μl，BIOG^HSC Super Enzyme Mix 0.5μl，RT-PCREnhancer 0.5μl，H5、N6上游引物(10μM)0.5μl，H5、N6下游引物(10μM)0.5μl，探针(20μM)0.5μl，Rnase-free ddH₂O 3.5μl，模板核酸4μl；

实时荧光定量PCR反应条件为：42℃20min，95℃10min，(95℃15s，55℃35s，72℃45s)共40个循环，72℃10min；

③用10倍梯度稀释的含有H5、N6基因片段的线性质粒作为标准品进行实时荧光定量PCR，体系如下：

2×BIOG^HSC Super Probe Master Mix 10μl，H5、N6上游引物(10μM)0.5μl，H5、N6下游引物(10μM)0.5μl，线性质粒模板2μl，探针0.5μl，50×ROX Reference Dye0.4μl，Taq酶保护液0.2μl，ddH₂O 5.9μl，反应程序为95℃10min，(95℃15s，55℃35s，72℃45s)共40个循环，72℃10min，以质粒拷贝数的Log值为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。