[发明专利]一种H5N6双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种H5N6双重荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：2×BIOG^HSC S uper MultiProbe Mix，BIOG^HSC Super Enzyme Mix，H5‑F、H5‑R、N6‑F、N6‑R引物，H5‑P、N6‑P探针，RT‑PCR Enhancer，Rnase‑free ddH₂O，50×ROX Reference Dye，T aq酶保护液，2×BIOG^HSC Super Probe Master mix，阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有H5和N6基因片段的线性质粒，所述阴性对照为PBS；本发明的有益效果是提供了一种特异性、稳定性、灵敏性都较好的用于检测禽流感病毒H5N6亚型的检测试剂盒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H5N6双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

流感病毒是一种常见的呼吸道传染病病原，也是一种具有囊膜的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科，根据其核蛋白(necleoprotein，NP)和基质蛋白(Matrix protein，)的抗原性及基因进化关系，又分为A、B、C、D四个型，其中A型流感病毒危害最大，其宿主广泛，可感染人、禽类、马、猪、犬、猫、貂、虎、海豹、鲸，其传染性强、传播速度快且极易发生变异，难防难控，常引起人间大流行和养殖场疫情，给人类健康和世界经济带来严重的损失。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于A型流感病毒，HA和NA为流感病毒表面的两个主要抗原，HA主要功能为特异性识别宿主细胞表面的受体，HA是流感病毒刺激机体产生抗体的主要抗原，NA具有唾液酸酶活性，在病毒完成胞内辅助后的释放阶段发挥重要作用，切断子代病毒与宿主细胞的黏连，使其进一步去感染其他宿主细胞。A型流感病毒根据其表面抗原HA和NA的抗原性不同，可以分为H1-H18 HA亚型和N1-N11 NA亚型，目前，流行的主要亚型为H1N1、H2N 2、H3N2，近年来发现H5N1、H9N2和H7N7等亚型流感病毒也可以感染人，在禽类中流行的主要亚型为H5N1、H5N6、H7N7、H9N2、H6N6、H5N8、H10N8和H5N6。

1975年在北美的绿头鸭体内首次分离到H5N6亚型禽流感病毒，在过去，H5N6病毒呈现的是一种低致病性病毒的特性，主要在美国、德国和瑞典的禽类中流行，很少产生症状，对人类健康及家禽养殖业影响不大，然而，近年来，在亚洲国家，爆发了一系列H5N6疫情，病死率极高，呈现了高致病性的特征，给家禽养殖业带来了严重的损失，2014年2月，湖南长沙一位5岁女童出现发热、咽喉肿痛等症状到医院就诊，随后咽拭子诊断为H5N6阳性，说明H5N6亚型禽流感病毒可以跨物种感染人，多种形式的基因重组均可导致全新的H5N6产生，而且在这个过程中部分H5N6获得了适应人的受体结合特异性，增强了复制能力、毒力和耐药力，最终导致了人感染病例的发生。

荧光定量实时逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative reversetranscription po lymerase chain reactin，RT-PCR)可区分AIV的亚型。建立针对H5亚型的HA基因、N6亚型的NA基因的双重实时荧光RT-PCR方法，可以提高工作效率，但是，目前缺少特异性、稳定性好、灵敏性强的用于检测禽流感病毒H5N6亚型的引物对和探针。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性、稳定性、灵敏性强的检测禽流感病毒H5N6亚型的引物对和探针。

本发明的特异性型引物序列见表1：

表1引物和探针

所述H5探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；N6探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ1标记。