[发明专利]一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法

权利要求书

1.一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，其特征在于，包括T-2毒素、HT-2、NEO、T-2triol、T-2tetraol、胎牛血清(FBS)、DMEM培养液、HBSS、猪LCs细胞、0.25％浓度的胰蛋白酶溶液、青霉素-链霉素(10000Units/mL-10000μg/mL)、二甲基亚砜、CCK-8试剂和多功能荧光酶标仪。

2.根据权利要求1所述的一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，其特征在于：所述猪LCs细胞在含10％FBS、1％青霉素-链霉素的DMEM培养液中，于饱和湿度为5％CO₂、37℃培养箱中常规培养。

3.采用权利要求1所述的一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，其特征在于，包括如下步骤：

T1、猪LCs为贴壁细胞，每隔2d可进行传代培养，传代时：将培养液吸出，加入1～2mLHBSS洗去血清，加入2mL0.25％胰蛋白酶溶液消化1min，待细胞变圆出现间隙立即加入1mL完全培养液终止消化，轻轻吹打至细胞悬液，200g离心5min，弃去上清，完全培养液重悬细胞，吹打均匀后分装，于培养箱中培养；

T2、取处于对数期生长的细胞消化、收集制成细胞悬液，计数并调整细胞浓度为4×10³个/孔接于96孔板中，贴壁24h后更换含有不同浓度T-2毒素、HT-2、NEO、T-2triol和T-2tetraol的完全培养液100μL，对照组只含细胞，空白组只含培养液，染毒培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃培养箱中染色培养2h，测量A450值，每组均设6个平行；

各毒素先以DMSO溶解制成储备液，然后用完全培养液稀释成工作浓度，控制完全培养液中DMSO浓度0.1％以下，其中单一毒素染毒终浓度分别为：T-2毒素：1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50nM；HT-2：3.125、6.25、12.5、25、50、100nM；NEO：0.09375、0.1875、0.375、0.75、1.5、3μM；T-2triol：0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μM；T-2tetraol：0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μM，二元和三元联合染毒以单一毒素达到50％细胞增殖抑制率时的浓度为基准，做定比混合(T-2毒素+HT-2：1:2；T-2毒素+NEO：1:30；HT-2+NEO：1:15；T-2毒素+HT-2+NEO：1:2:30；T-2毒素+T-2triol：1:10；T-2毒素+T-2tetraol：1:100；T-2triol+T-2tetraol：1:10；T-2毒素+T-2triol+T-2tetraol：1:10:100，并以2倍梯度稀释，共设5个浓度，细胞活性公式计算如下：

T3、根据T-2毒素及其四种代谢物的剂量效应曲线，采用Chou-Talalay联合指数法中的中位效应方程计算五种毒素的中位效应剂量：其中D为真菌毒素的浓度，fa为细胞增殖抑制率，fu为细胞活性(fu＝1–fa)，Dm为中位效应剂量即IC50，m表示剂量效应曲线的形状指数(m＝1，m1，和m1分别表示剂量-效应曲线为双曲线，S型曲线，平滑S型曲线)，方程用于评价五种毒素的单独毒性。

当多种毒素共同暴露时，依据中位效应原则演变而来的组合指数法(combinationindex，CI)用于评估毒素的联合效应类型，计算公式如下：

其中，ⁿ(CI)_x为n种毒素联合作用细胞抑制率为x％时的组合指数，(D)_j为n种毒素联合作用达到x％细胞抑制率时的总剂量，而(D_x)_j为组合中每种毒素单独作用时达到x％细胞抑制率的剂量。整体上，当CI＝0.9-1.1，CI0.9和CI1.1时分别代表联合效应的类型为加和，协同和拮抗。

当混合物的联合毒性表现为协同效应的时候，剂量减少指数被用来进一步评估协同效应，DRI为毒素联合作用达到x％细胞抑制率时，混合物中各毒素剂量与各毒素单独作用时达到x％细胞抑制率的剂量相比下降，混合物中各毒素的DRI计算公式如下：

和

T4、基于细胞线粒体中脱氢酶活性与细胞活性密切相关，使用增强型CCK-8试剂盒对经T-2毒素及其四种代谢产物进行了细胞毒性检测，暴露于不同水平的五种毒素24小时后，细胞活力均以剂量依赖性方式降低，且每种毒素的IC50值不同，从IC₅₀值来看，T-2毒素是对猪LCs毒性最强的毒素，且所有真菌毒素对猪LCs的细胞毒性大小依次为：T-2毒素HT-2T-2triolNEOT-2tetraol。