[发明专利]一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法

说明书

本发明公开了一种T‑2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，包括T‑2毒素、HT‑2、NEO、T‑2triol、T‑2tetraol、胎牛血清（FBS）、DMEM培养液、HBSS、猪LCs细胞、0.25%浓度的胰蛋白酶溶液、青霉素‑链霉素（10000Units/mL‑10000μg/mL）、二甲基亚砜、CCK‑8试剂和多功能荧光酶标仪，本发明的有益效果：为评估T‑2毒素及其4种主要代谢物对猪LCs的细胞毒性作用，在CCK‑8检测细胞活力的基础上，使用组合指数法研究了各毒素联合作用时的类型，为食品或饲料中A型单端孢霉烯族真菌毒素及其代谢产物联合污染的危害评估、风险预警提供数据依据。

技术领域：

本发明属于毒性评估方法技术领域，特别涉及一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法。

背景技术：

T-2毒素是A型单端孢霉烯族毒素中毒性最强的毒素之一，人畜误食被其污染的饲料或食品之后会引发多种急性、慢性中毒，如呕吐、体重减轻、恶心、腹泻、炎症和不育等，而且T-2毒素难挥发、易溶于水、熔点高、热稳定性强还有较强的紫外线耐受性。因此，在食物生产、加工、储藏、运输等过程中常见的加工方式一般不能对其产生破坏，极易污染各类粮食作物或瓜果蔬菜。当人类或动物食用这些被污染的粮食制品之后，会出现不同程度的中毒症状或是动物体内残留蓄积造成动物源食品的污染后，会间接对人类身体健康造成进一步伤害。在分子水平上，T-2毒素对真核细胞的初级代谢具有多种抑制作用，包括损伤免疫功能，抑制蛋白质、RNA和DNA的合成，促进氧化应激，破坏能量代谢、细胞周期和线粒体以及诱导细胞凋亡。不仅如此，T-2毒素在人或动物体内还能进一步代谢转化。主要代谢途径是在C-4位置快速脱乙酰化，形成HT-2。在哺乳动物中，T-2毒素另一个重要的代谢途径就是水解生成NEO、T-2triol和T-2tetraol，这些代谢物均属于A型单端孢霉烯族毒素，T-2毒素除了能在动物细胞或组织中共存，还与其代谢物自然存在于粮食谷物当中。通常T-2毒素和HT-2以相对较高的浓度共存，痕量的NEO，T-2triol和T-2tetraol也已在燕麦，小麦和玉米副产品中检测到，然而目前关于T-2毒素及其代谢产物的联合毒性报道较少，T-2毒素能够引起小鼠精液/精子异常，大鼠妊娠率下降等生殖毒性，这表明生殖细胞系为人类研究单端孢霉烯族毒素引起的生殖毒性提供了另一个敏感的靶点。

发明内容：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种技术方案：

一种T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，包括T-2毒素、HT-2、NEO、T-2triol、T-2tetraol、胎牛血清(FBS)、DMEM培养液、HBSS、猪LCs细胞、0.25％浓度的胰蛋白酶溶液、青霉素-链霉素(10000Units/mL-10000μg/mL)、二甲基亚砜、CCK-8试剂和多功能荧光酶标仪。

作为本发明的一种优选技术方案，所述猪LCs细胞在含10％FBS、1％青霉素-链霉素的DMEM培养液中，于饱和湿度为5％CO₂、37℃培养箱中常规培养。

优选的,采用上述T-2毒素与代谢产物联合污染的毒性细胞评估方法，其具体使用步骤为：

T1、猪LCs为贴壁细胞，每隔2d可进行传代培养，传代时：将培养液吸出，加入1～2mLHBSS洗去血清，加入2mL0.25％胰蛋白酶溶液消化1min，待细胞变圆出现间隙立即加入1mL完全培养液终止消化，轻轻吹打至细胞悬液，200g离心5min，弃去上清，完全培养液重悬细胞，吹打均匀后分装，于培养箱中培养；