[发明专利]一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

说明书

本发明公开了一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑TTTCTTCTATTCGCGATCTCATACAACTTACTTATCTCATTTCTTTACC‑3’(SEQ ID NO：1)或5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG‑TTTCTTCTATTCGCGATCTCATACAACTTACTTATCTCATTTCTTTACC‑CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’(SEQ ID NO：2)。本发明的ssDNA核酸适配体对哈维氏弧菌具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体结构稳定、易修饰，便于合成和保存，可对哈维氏弧菌进行快速准确的检测和诊断。

技术领域

本发明涉及一种ssDNA核酸适配体及其应用，特别是涉及一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用。

背景技术

哈维氏弧菌又称哈氏弧菌，是海洋中常见的一种病原菌。哈维氏弧菌隶属于弧菌科中的弧菌属，主要感染虾及鱼类。哈维氏弧菌在海洋环境中分布范围很广，是海水中一种常见的病原菌，主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中。通常情况下，它是水产动物体表的正常菌群，只有在宿主体质变弱、菌株发生变异或者环境条件发生改变时，哈维氏弧菌才开始大量繁殖，侵染宿主。

目前对哈维氏弧菌的检测方法主要包括基于细菌生理生化反应的检测方法，基于抗体的免疫学检测技术，以及聚合酶链式反应(PCR)等。这些方法存在操作繁琐、检测耗时长、试验试剂保存条件苛刻等不足，无法满足养殖户在养殖现场对病原性哈维氏弧菌的快速准确检测的要求。因此应着力发展成本低、耗时短、操作便捷、灵敏度高的致病菌快速检测技术，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失极为重要。

指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment technology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，是基于分子生物学的认识：核酸分子与蛋白质分子等在体内的特异性相互作用，是基因转录、核酸复制、蛋白表达等一系列基本生命活动有序进行的保证。SELEX技术的基本原理：人工合成单链核酸文库(单链DNA或RNA)，文库含40nt左右的随机序列，其可能的序列理论上可达4⁴⁰种。一级序列的多样性，也导致了单链DNA或RNA二级和三级结构的多样性。这些不同序列与不同空间结构的核酸，经过多个循环的筛选，多种靶物质，如蛋白质、核酸、小肽和氨基酸等有机分子，甚至金属离子，在理论上都可以找到与之特异并稳固结合的核酸序列。经过多轮循环筛选及PCR/RT-PCR技术的扩增，再经克隆测序鉴定，进而可以大量生产并纯化得到与靶物质结合的这一段特异序列的核酸链-配基，也称核酸适配子或适配体。

核酸适配体能够特异性与靶物质牢固结合，因而可以在很大程度上相当于抗体的作用，而且在一些抗体还无法应用的领域也能发挥作用。适配子可以作为诊断试剂，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式，还可以应用于临床治疗等。

核酸适配体具有易筛选、易修饰、稳定性强、高特异性识别靶标分子等优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具。首先，SELEX技术筛选周期短，通常核酸适配体的筛选需要6-30个SELEX循环，约3-8周的时间。而针对靶标分子筛选、制备特异性的生物抗体等则需要长达3-8个月的时间，且抗体存在成本高、易失活、保存条件苛刻、批次间的抗体质量存在差异等问题。其次，SELEX技术是在体外进行的化学筛选过程，因此靶标分子范围广范从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为SELEX筛选的靶标分子，特别是具有细胞毒性、无免疫原性或者免疫原性弱的靶标分子，均能够使用SELEX技术在体外进行高特异性核酸适配体的筛选。因此，核酸适配体的研究日益受到国内外生物化学、生物医学、纳米材料、蛋白质科学等多学科研究者的广泛关注。目前，核酸适配体已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

发明内容