[发明专利]一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法

权利要求书

1.一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、胚性愈伤诱导

采集红松的未成熟球果，取出未成熟种子消毒，剥去种皮，用双氧水处理6～10min，无菌水冲洗3～5次后，得到灭菌后的种仁，然后接种在诱导培养基上，在24±1℃条件下暗培养两个月，即得到胚性愈伤组织；

二、胚性愈伤增殖

将胚性愈伤接增殖培养基A上，在23～25℃的条件下，暗培养14d，得到增殖的胚性细胞团；

三、体胚成熟培养

将增殖的胚性细胞团，置于灭菌离心管中，然后加入增殖培养基B，震荡，胚性细胞团分散形成悬浮液；将灭菌的滤纸置于灭菌的布氏漏斗上，用移液枪吸取悬浮液，均匀平铺于滤纸上，吸干滤纸上液体，将滤纸置于成熟培养基上，在23～25℃的条件下，暗培养40～60d，得到体胚；

四、体胚萌发

将发育正常的体胚置于空气相对湿度为90％-98％、4℃条件下暗培养7d，然后将体胚取出转移至萌发培养基中进行萌发，即完成。

2.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤一中消毒方式为：用75％的酒精处理1～2min，无菌水冲洗3～5次；用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液处理15min，无菌水冲洗3～5次。

3.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤一中双氧水的质量浓度为3％。

4.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤一的诱导培养基为：DCR基本培养基+琼脂6.5g·L^-1+L-谷氨酰胺500mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+NAA 2mg·L^-1+6-BA 1.5mg·L^-1+水解酪蛋白0.5g·L^-1，高压灭菌前调节pH至5.8。

5.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤二增殖培养基A为：DCR基本培养基+蔗糖30g·L^-1+2,4-D 0.5mg·L^-1+6-BA 0.1mg·L^-1+水解酪蛋白500g·L^-1+L-谷氨酰胺500mg·L^-1+琼脂6.5g·L^-1。

6.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤三增殖培养基B为：DCR基本培养基+蔗糖30g·L^-1+水解酪蛋白500g·L^-1+L-谷氨酰胺500mg·L^-1。

7.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤三所述的成熟培养基为mLV培养基+结冷胶1.2％+脱落酸80umol·L+蔗糖0.2mol·L^-1+L-谷氨酰胺500mg·L^-1+酸水解酪蛋白0.8g·L^-1+1g·L^-1的活性炭，培养基pH＝5.8。

8.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤三增殖的胚性细胞团与增殖培养基B的质量体积比为20mg:1mL。

9.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于步骤四所述的萌发培养基为mLV培养基+蔗糖25g·L^-1+0.4％结冷胶。

10.根据权利要求1所述的一种低温处理提高红松体胚萌发率的方法，其特征在于其中步骤四将体胚取出转移至萌发培养基中，在23～25℃的条件下暗培养15d后统计体胚萌发率。