[发明专利]一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，至少包括以下步骤：(1)配制琼脂培养基；(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞接种于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组，连续培养21天后于显微镜下，观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况，从而判定细胞的体外成瘤状况。所述步骤(2)中观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。使用50μm作为判断标准，能够提高判断的对比明显度与准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法。

背景技术

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞的来源广泛，主要来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞和心肌细胞等多向分化的潜能。并且间充质干细胞易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。一些细胞在体外培养时，存在体外成瘤的可能性，但是现有的关于间充质干细胞在体外培养时，体外成瘤的检测方法不明显，不能有效的判断人间充质干细胞在体外培养时成瘤的可能性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种高对比明显度的干细胞体外稳定性的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)配制琼脂培养基；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞接种于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组，连续培养21天后于显微镜下，观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况，从而判定细胞的体外成瘤状况。

优选的，所述步骤(2)中观察人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞的集落状况时，以50μm作为判断标准，＜50μm为非集落细胞，≥50μm且大于16个细胞为集落细胞，存在集落细胞认定为存在体外成瘤的可能性。

优选的，所述琼脂培养基包括不相融合的底层琼脂培养基和上层琼脂培养基。

优选的，所述底层琼脂培养基的制备原料包括1％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

优选的，所述上层琼脂培养基的制备原料包括0.7％(M/V)的琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基，所述琼脂溶液、DMEM培养基和RPMI1640培养基之间的体积比为：3:3(1-3)。

优选的，所述1％(M/V)的琼脂溶液和0.7％(M/V)的琼脂溶液均在121℃下，经过30-60min的灭菌。

优选的，所述DMEM培养基为高糖培养基。

优选的，所述RPMI1640培养基中的胎牛血清浓度为10-15％wt。

优选的，所述步骤(2)中的将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞放置于琼脂培养基中进行培养，并设置空白对照组的具体操作方法至少包括以下步骤：

(1)取底层琼脂培养基分别加入4个6孔板中，2-3ml/孔，静置使其凝固备用；

(2)将人间充质干细胞、人宫颈癌细胞和人胚肺成纤维细胞分别接种于3个凝固有底层琼脂培养基的6孔板中；

(3)取上层琼脂培养基分别加入上述6孔板中，2-3ml/孔，其中未接种细胞的作为对照组。