[发明专利]一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌采集人体脂肪；

(2)胶原酶消化；

(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；

(4)脂肪间充质干细胞传代培养；

(5)脂肪间充质干细胞冻存；

(6)脂肪间充质干细胞质量检验；

(7)脂肪间充质干细胞入库。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，包括：首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤4-6次。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO₂培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞贴壁情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。

4.根据权利要求3所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述培养箱的条件为温度37℃、5％CO₂，湿度94～96％。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述传代培养的传代完成的标志为细胞融合度达到80％。

6.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述干细胞冻存用的冻存保护液包括：DMSO 10v/v％-20v/v％、培养基40v/v％-50v/v％、人血清白蛋白40v/v％-50v/v％。

7.根据权利要求6所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述培养基无血清，包括基础培养基、重组胰岛素、重组生长因子、人血白蛋白、转铁蛋白。

8.根据权利要求7所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为低糖型DMEM培养基、高糖型DMEM培养基、MEM培养基中的一种。

9.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述干细胞质量检验项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、STR图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。

10.根据权利要求9所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述病毒检测包括ABO/RH血型分型、HLA分型、HIV、HBV、HCV、TP检测。