[发明专利]一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法

说明书

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌采集人体脂肪；(2)胶原酶消化；(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养(4)脂肪间充质干细胞传代培养；(5)干细胞冻存；(6)干细胞质量检验；(7)干细胞入库。脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞，并且脂肪组织来源丰富，体内的储备量大，取材相对容易，少量组织即可以获得大量的干细胞，衰亡率低等优势，因此建立脂肪间充质干细胞工作细胞库能够为细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源，为临床应用提供潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种工作细胞库的制备方法，具体涉及一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

脂肪间充质干细胞(Adipose Mesenchymal Stem Cells,ADSC)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。由于脂肪组织来源丰富，体内的储备量大，取材相对容易，少量组织即可以获得大量的干细胞，衰亡率低等优势，因此人脂肪间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值。

干细胞工作库就是将干细胞置于深低温状态下长期保存，一个完善的干细胞工作细胞库能够为临床细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源。目前，国内已经建立了人脐带干细胞库，胎盘干细胞库、骨髓干细胞库，但对于脂肪间充质干细胞工作细胞库的构建和制备的相关研究较少，技术不够成熟。

发明内容

为了克服现有技术的不足，提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，能够为脂肪间充质干细胞的临床应用提供价值。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：

(1)无菌采集人体脂肪；

(2)胶原酶消化；

(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；

(4)脂肪间充质干细胞传代培养；

(5)脂肪间充质干细胞冻存；

(6)脂肪间充质干细胞质量检验；

(7)脂肪间充质干细胞入库。

作为一种优选的方案，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤4-6次。

作为一种优选的方案，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO₂培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞生长情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。

作为一种优选的方案，所述培养箱的条件为温度37℃、5％CO₂、湿度94～96％。

作为一种优选的方案，所述传代培养的传代完成的标志为细胞融合度达到80％。