[发明专利]一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法

说明书

本发明公开了一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法，取新鲜的无花果组织材料进行液氮冷冻和充分研磨处理，处理后再进行DNA提取；利用无花果雄性特异性引物（AG‑Maker）对提取的DNA模板进行PCR扩增；取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后将胶块置于凝胶成像仪中观察和鉴定；雄性特异性条带的长度为146bp，如果目的条带存在则证明该无花果植株为雄树，反之即为雌树。本发明的无花果性别鉴定方法简便、高效，而且不受季节和无花果组织部位的限制，可以对大量的无花果杂交后代群体进行定植前筛选，节省了大量资源和成本的投入。本发明方法是解决无花果实生苗性别区分难题的有效途径，属于国内首创，准确率达到99.9％。

技术领域

本发明植物性别鉴定方法技术领域，具体的说是涉及一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法。

背景技术

无花果是一种具有甜美果肉和丰富营养价值的果实，深受人们的喜爱。然而，无花果是一种雌雄异株的古老果树，产业中仅将无花果雌树的果实用于生产加工。由于雄树果实存在花粉和瘿花，取食过程中会造成食用者观感和口感上的不适，所以无论是异地引种还是杂交育种都会选择保留无花果雌树，淘汰无花果雄树。有性杂交育种是无花果新品种培育最为有效的手段，通常情况下，无花果雌雄个体杂交F1代中雌雄比例约为1：1。然而，多数育种者仅需要保留富含凝胶状果肉更多的无花果雌树进行下一步的新品种筛选和测试。遗憾的是，传统的观察法需要等待实生苗完成营养生长，约2～3年的时间，才能结出可以用于区分性别的果实。所以，多余的无花果雄树必然会造成资源的极大浪费。

现有技术中与无花果实生苗性别鉴定相似的专利文献有许多，这里我们举例列出如下三篇：1、浒苔性别鉴定（专利号201910885352.2），该方法还需进行目的片段的回收、质粒连接、目标片段测序和序列分析；2、柿树性别鉴定（专利号202011009770.4），该方法还需要对PCR产物进行测序以及测序结果分析；3、椰枣树性别鉴定（专利号202011238725.6），该方法还需要进行荧光定量PCR扩增和溶解曲线图的分析，才能对其性别进行区分。目前现有技术中，还没有无花果实生苗性别鉴定的技术，如果能够找到一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法，将会满足无花果育种者们的迫切需求。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种适用于无花果实生苗的性别鉴定方法，该性别鉴定方法具体包括如下步骤：

（1）取新鲜的无花果组织材料，放入液氮中迅速冷却，然后取适量材料丢入研钵中快速研磨成粉末，取30mg植物组织粉末置于2mL的离心管中，丢入液氮中备用；

（2）对无花果组织进行DNA的提取，DNA的提取方法采用CTAB法或采用植物组织DNA提取试剂盒提取均可；

（3）按照PCR酶说明书配置反应体系，扩增模板选择步骤（2）中提取的无花果组织DNA，扩增引物为雄性特异性引物AG-Maker：

正向引物序列AG-Maker-F：5’-CAGGAGGAGGAAGCT-3’；

反向引物序列AG-Maker-R：5’-TTACACTAATTGGAGGGCCA-3’；

（4）继续按照PCR酶说明书中的扩增程序将已配好的反应体系置于基因扩增仪中进行PCR扩增；

（5）取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

（6）取胶块于凝胶成像仪中观察是否存在目的条带，雄性特异性条带的长度为146bp，如果目的条带存在则证明该无花果植株为雄树，反之则为雌树。

步骤（1）中，无花果组织材料为无花果幼苗的根、茎或叶片。或者无花果组织材料为无花果树的根、茎、叶、花蕊或果皮。有必要的话，可以将充分研磨过的无花果组织材料装入离心管中，放置于-80℃的冰箱中长期储存备用。