[发明专利]一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于：所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第104位的苏氨酸突变为赖氨酸；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第179位的异亮氨酸突变为亮氨酸；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第232位的天冬氨酸突变为丝氨酸。

2.一种编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。

4.一种根据权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将SEQ ID NO.1所示序列与pET-28a(+)质粒连接，构成重组表达载体pET-28a(+)-EHJ；

S2、以重组载体pET-28a(+)-EHJ为模板，利用特异性定点突变引物构建环氧化物水解酶突变体重组表达载体；

S3、将重组载体pET-28a(+)-EHJ及突变体载体热击转化感受态细胞，涂布抗性LB固体培养基中，过夜培养后进行菌落PCR验证；

S4、将经过验证的阳性克隆子提取质粒，转化E.coli BL21(DE3)后再次筛选出阳性克隆子，接种至含硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，再按体积分数为2％的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃和200rpm的条件下摇床振荡培养，当培养液OD600达到合适值时，加入IPTG作为诱导剂进行诱导表达。

5.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2所述特异性定点突变引物为：

Thr104-F：GTAGAGCTTCTCAAGGATGGTTGGGAAC；

Thr104-R：GTTCCCAACCATCCTTGAGAAGCTCTAC；

Ile179-F：GTGCAGCGACTTTATCGGGCATTGCTCCGT；

Ile179-R：ACGGAGCAATGCCCGATAAAGTCGCTGCAC；

Asp232-F：CGACTTTCTGGTTTCAAGTATAAGCGAA；

Asp232-R：TTCGCTTATACTTGAAACCAGAAAGTCG。

6.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞，所述抗性LB固体培养基为含卡那霉素抗性的LB固体培养基。

7.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤S4所述含硫酸卡那霉素的LB培养基中硫酸卡那霉素的浓度为50mg/L。

8.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤S4所述培养液OD600的合适值为0.6-0.8。

9.根据权利要求4所述的环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤S4所述IPTG诱导剂的浓度为0.5mmol/L，诱导条件为在28℃条件下培养10h。