[发明专利]一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法，环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第104位、第179位和第232位的氨基酸序列进行单点突变获得。制备方法：将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET‑28a(+)中，构建重组质粒pET‑28a(+)‑EHJ；利用定点突变技术获得环氧化物水解酶突变体；将含有编码正确突变体基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆并提取质粒；转化大肠杆菌并诱导表达。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明环氧化物水解酶突变体能提高酶的热稳定性与酶活性，可以提高工业化生产中环氧化物水解酶的适用寿命。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别涉及一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法。

背景技术

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH,EC,3.3.2.-)又称环氧化物水合酶或环氧水化酶，是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应12-二醇的水解酶，来源广泛，先是由Brooks等人于40多年前发现，而后在细菌、酵母、霉菌、植物、昆虫以及哺乳动物等所有类型的有机体中均发现了其存在，研究表明该酶参与催化不需要辅酶并可以立体选择性的将环氧化物水解拆分为手性环氧化物及相应的邻二醇。通过分析来源于微生物的环氧化物水解酶的序列信息，发现其大多属于α/β折叠水解酶家族，且该类型酶高的对映体选择性使得它们对于制备各类手性药物和精细化学品具有重要意义。

目前，生产环氧化物水解酶的方法主要有两种，其中，化学法存在成本较高，副产物多，环境压力大等缺点。基因克隆表达技术虽然提高了微生物EH不对称拆分环氧化物的活力,但在提高对映体选择性方面的作用不显著，在研发生产中这将造成反应速度慢、敏感度低的问题，从而导致生产周期的延长，金钱、人力的消耗。

总之，现有发明提供的环氧化物水解酶组作用效果一般，敏感度较低，在65℃下的半衰期较野生型缩短，伴随着热稳定性的提高，催化效率却大大降低，在工业生产中酶催化效率降低将无法正常产出合格产品，对于生产的研发来说将会大大延长生产周期，在无形中对人力、金钱都造成了相当大的损耗。此外，相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，现有改良技术虽然缩短了酶学性质改造时间，但在酸性pH环境和中低温环境范围内稳定有所下降。当环境发生变化时，生产产品质量得不到保障，会造成产率低、合格率低等问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种不仅催化效率高，而且热稳定性好、酶活强的环氧化物水解酶突变体。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种环氧化物水解酶突变体，所述环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第104位、第179位和第232位的氨基酸序列进行单点突变获得。

进一步地，所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第104位的苏氨酸突变为赖氨酸；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第179位的异亮氨酸突变为亮氨酸；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第232位的天冬氨酸突变为丝氨酸；

本发明还提供一种编码所述环氧化物水解酶突变体的基因，所述突变体基因的碱基序列是以SEQ ID NO.1为基础进行突变的。

本发明还提供一种携带所述环氧化物水解酶突变体基因的重组载体。

第二方面，本发明还提供一种环氧化物水解酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

S1、将SEQ ID NO.1所示序列与pET-28a(+)质粒连接，构成重组表达载体pET-28a(+)-EHJ；